Aula 4 - Tecnologia do Dna Recombinante

LGN0232 - Genética Molecular Tecnologia do DNA recombinante: Clonagem, PCR e sequenciamento 4ª aula Antonio Figueira CENA figueira@cena.usp.br O que significa Clonagem? pBR322 1º plasmídeo - 1977 Bolivar et al. 1977 Plasmídeos naturais pBR322 = R1 + R6.5 + pMB1 Transformação com pBR322 pUC8 1982 Vieira & Messing (pBR322 and M13mp8) Ampicillin resistance gene pUC8 2.7 kb lacZ' gene Cluster of unique restriction sites HindIII PstI SalI, AccI, HincII BamHI SmaI, XmaI EcoRI Recombinant pUC8 DNA insert β-galactosidase produced X-gal split to blue product Agar + ampicillin + X-gal No β-galactosidase X-gal not split Formação de uma molécula de DNA recombinante Ferramentas de clonagem Hospedeiros: Escherichia coli leveduras células animais células vegetais células de insetos,.. Vetores: plasmídeos fagos (vírus de bactérias) cosmídeos cromossomos artificiais (YAC, BAC) Enzimas: enzimas de restrição DNA ligase ‘Atores’ no DNA Recombinante Vetores de clonagem – multiplicam moléculas de DNA recombinante (clones) em organismos vivos, gerando quantidades abundantes de clones DNA ‘quimera’ DNA recombinante Fragmentos de DNA ligados a um vetor de clonagem Vetor Inserto Escherichia coli • Presente no intestino humano • Patogênica • Identificada em 1855 pelo Dr. Theodor Escherich • Cepa O157:H7 patogênica a humanos (enterohemorrágica) • Fator virulência: TypeII Secretion System • Cepa K-12 –comensal • Isolada em 1922 em fezes de paciente com difteria em Palo Alto • Estudos pioneiros da biologia molecular https://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes  Unicelular, na forma de bastão;  Cresce rapidamente a 37oC ;  ciclo de 20 min  Pouco exigente quanto a nutrição  Meio mínimo ou rico:  Glicose - melhor fonte de C  Extrato de levedura - vitaminas  Triptona e Peptona: fonte aminoácidos Escherichia coli Uma geração a cada 20 min! Progressão Geométrica do Crescimento Populacional Bacteriano Curva de crescimento Uma geração: 20 minutos • Usualmente não apresentam DNA plasmidial • Células das bactérias precisam ser preparadas • Tornar-se competentes = aptas a receberem a molécula de DNA recombinante • Na fase de crescimento exponencial! Bactérias para Transformação  DNA acessório circular – ocorrem naturalmente  Tipicamente de procariotos (mas pode ocorrer em eucariotos)  Replicação independentes do cromossomo  Tamanho variável – 1 a >200 kilo pares de bases  Contém genes de resistência a antibióticos, enzimas de restrição, e patogênese Vetores - Plasmídeos 1. Cromossomo 2. Plasmídeos 3. Origem de replicação ori 1. Resistência a antibiótico 2. Fator de patogênese conjugação https://www.dnalc.org/resources/animations/transformation1.html Formação de uma molécula de DNA recombinante Características para uso: 1. origem de replicação - ori 2. marcadores de seleção – resistência a antibiótico (AmpR, TetR, SpecR, KanR, ..) – gene lacZ - aminoterminal b-galactosidase – IPTG e X-Gal 3. sítio múltiplo de clonagem (MCS) 4. tamanho (quanto menor melhor!) Manipulação após purificação – larga escala – “mini-prep” ou lise alcalina Plasmídeos Mutação no gene rop –Permite um maior número de cópias por célula • Sistema lacZ Adicionar ao meio X-Gal= 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-galactopiranosídeo (branco/azul) IPTG = isopropiltiogalactose •Certas cepas de E. coli dispensam a necessidade de IPTG Plasmídeo pUC Regulator gene Control sites Structural genes Lactose operon A) i mRNA Repressor Repressor binds to the operator and prevents transcription of z, y, and a. B) lac mRNA β-Galactosidase Permease Transacetylase Inducer-repressor complex Lactose β-Galactosidase 1,6-Allolactose IPTG Galactose Glucose Clones resistentes a ampicilina Clones sensíveis a ampicilina Meio de Cultura + ampicilina Células transformadas Células controle (não transformadas) Quais colônias nos interessam e por quê? Uma bactéria é competente quando tem a capacidade de receber e multiplicar DNA exogeno. Incompetente!!! Células Competentes • Transformação química (choque térmico) • Eletroporação Inserção do Plasmídeo (DNA) dentro da Célula Bacteriana – Hospedeiro Transformação - poros Transformação Química Suspensão de células competentes + Moléculas de DNA recombinante = Incubar por 30 min no gelo Choque térmico (42°C/30 s) Mecanismo molecular proposto para explicar a transformação de E. coli com uma molécula de DNA exógeno. Mandel & Higa, 1970 Transformação Química ANIMAÇÃO https://www.dnalc.org/resources/animations/transformation2.html Eletroporação Suspensão de células Eletrodo Eletrodo Cuveta Pulso elétrico Eletroporador Construção Célula de E.coli Transformação Meio seletivo Clones recombinantes Seleção de Clones Recombinantes Ex: Meio com antibiótico (ampicilina) Seleção de Clones Recombinantes Período de incubação = 12-16 h a 37°C Meio LB +X-gal+ampicilina Utilizados marcadores que são inativados com a inserção do DNA exógeno no plasmídeo Ex. sistema de diferenciação branco-azul • Plasmídeos da série pUC possuem um gene (gene lacZ) que codifica a produção da enzima β-galactosidase. A inserção do DNA exógeno (inserto) no sítio de clonagem do plasmídeo causa a interrupção do gene, levando à perda da função da β-galactosidase. Como resultado: • colônias brancas (β-gal inativa) - positivas (com inserto) • colônias azuis (β-gal ativa) - negativas (sem inserto) Seleção de Clones Recombinantes Gene lacZ = codifica a enzima β-galactosidase Produção da enzima β-galactosidase X-gal é clivado = colônia azul Não há produção da enzima β-galactosidase X-gal não é clivado = colônia branca Ágar + ampicilina + X-gal Sítio múltiplo de clonagem pUC8 Vieira & Messing, 1982 Gene de resistência à ampicilina Seleção de Clones Recombinantes Plasmídeo com inserto Resistência à ampicilina LacZ não funcional Colônias brancas Sem plasmídeo Sem resistência à ampicilina Sem gene LacZ Sem crescimento Célula bacteriana DNA cromossomal Possíveis Resultados após a Etapa de Transformação Plasmídeo sem inserto Resistência à ampicilina LacZ funcional Colônias azuis *MC = Meio de cultura MC+X-gal+amp MC+X-gal+amp MC+X-gal+amp Amp. Amp. Inserto Enzimas de Restrição • Bacteriófagos - > vírus infectam bactérias • 1950s - fagos infectam cepas específicas • certos fagos “restritos” a certas cepas (Luria) • 1962 - endonuclease clivam DNA não protegido • DNA não protegido degradado por endonuclease restringindo infecção • 1968 - purificação 1a endonuclease de restrição • 1970 - purificação e caracterização HindII • corte mesmo sítios - mapa de restrição Simian Virus 40 Tipos de Enzimas de Restrição Recognition sequence Type I or III restriction endonuclease Type II restriction endonuclease DNA Cuts made at variable positions All cuts at the same position Tipos de Terminação (A) Blunt and sticky ends Blunt ends Sticky ends 5' and 3' overhangs BamHI PstI Sau3AI The same sticky end produced by different enzymes Enzima Sequência Reconhecimento Tipo Terminação Sequências Finais AluI 5'-AGCT-3' 3'-TCGA-5' Blunt 5'-AG CT-3' 3'-TC GA-5' Sau3AI 5'-GATC-3' 3'-CTAG-5' Sticky, 5' overhang HinP1I 5'-GANTC-3' 3'-CTNAG-5' Sticky, 5' overhang BamHI 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5' Sticky, 5' overhang BsrBI 5'-CCGCTC-3' 3'-GCGGAG-5' Blunt EcoRI 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5' Sticky, 5' overhang PstI 5'-CTGCAG-3' 3'-GACGTC-5' Sticky, 3' overhang NotI 5'-GCGGCCGC-3' 3'-CCGGCGCC-5' Sticky, 5' overhang BglI 5'-GCCNNNNNGGC-3' 3'-CGGNNNNNCCG-5' Sticky, 3' overhang T4 DNA Ligase Papel in vivo (A) The role of DNA ligase in vivo Missing phosphodiester bond 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Missing bond synthesized by DNA ligase 5’ 3’ 5’ 3’ (B) Ligation in vitro 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Two bonds synthesized by DNA ligase (C) Sticky-end ligation is more efficient 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Transient base-pairing between sticky ends 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Two bonds synthesized by DNA ligase New DNA DNA polymerase III Next Okazaki fragment 5’ 3’ 5’ 3’ DNA polymerase III stops when it reaches the RNA primer 5’ 3’ 5’ 3’ DNA polymerase I continues synthesis 5’ 3’ 5’ 3’ DNA ligase links the two DNA fragments Clonagem Molecular RESUMO DAS ETAPAS: 1. Preparação do vetor e do inserto 2. Ligação do vetor e inserto 3. Transformação em célula hospedeira 4. Seleção de clones 1. 2. 3. 4. Clonagem Independente de Células Vivas PCR PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase) • O processo de PCR foi inventado por Kary Mullis na década de 1980 Prêmio Nobel da Química 1993!! • É um método de amplificação (criação de múltiplas cópias) enzimática de DNA sem o uso de um organismo vivo, como por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras. http://www.karymullis.com/pcr.shtml PCR Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. 1988. Science 239: 487-491. • 1. Desnaturação (94-96ºC, 30-600 segundos). A cadeia dupla fita do DNA é separada em duas cadeias simples. A DNA polimerase deve ser estável a altas temperaturas pois é obtida de organismos que vivem em ambientes extremos (extremófilos). A DNA polimerase mais usada é a Taq polimerase (obtida de Thermus aquaticus). • 2. Annealing (emparelhamento, pareamento, hibridização) (45-80ºC, 30-120 segundos). Durante o emparelhamento, os iniciadores (primers) ligam-se ao DNA de cadeia simples e a DNA polimerase se liga aos iniciadores emparelhados. • 3. Alongamento (polimerização) (65-80º C, 30-120 segundos). A DNA polimerase cria a cadeia de DNA complementar à medida que percorre o DNA de cadeia simples, incorporando desoxirribonucleotideos presentes na reação. Após cada ciclo, a quantidade de DNA duplica. Assim, após múltiplas ciclos, o aumento da quantidade de DNA é exponencial de base 2. PCR: Polymerase Chain Reaction https://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU A amplificação é exponencial Gene desejado DNA Molde 1o ciclo 2o ciclo 4o ciclo 4 cópias 8 cópias 16 cópias 32 cópias 60 bilhões de cópias 35 ciclos http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=2153 Passo 1 – desnaturação 1 minuto – 94oC Passo 2 – anelamento 45 segundos– 55oC Passo 3 – extensão 45 segundos– 72oC Thermus aquaticus Thermus aquaticus: pode suportar temperaturas elevadas, uma de várias bactérias termófilas. Fonte da enzimas resistente ao calor como a Taq polimerase de DNA , um dos mais importantes enzimas na biologia molecular devido à sua utilização na reação em cadeia da polimerase (PCR), técnica de amplificação de DNA Thermus aquaticus A bactéria foi descoberta pela primeira vez no Lower Geyser Basin do Parque Nacional de Yellowstone DNA molde primers DNA polimerase A T C G nucleotídeos H2O + tampão Reação de PCR http://molbiol-tools.ca/PCR.htm Desenho de Primers Oligonucleotídeos Termociclador Visualizando o Fragmento Amplificado https://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html Aplicações de PCR Teste de paternidade, forense Detecção de patógenos Qual seria a aplicação na agricultura? Detecção de vírus • Método Maxam & Gilbert (1977)* - Método de degradação química • Método Sanger (1977) - Método enzimático, dideoxi ou de término da cadeia - Síntese enzimática de uma fita complementar de DNA, cujo crescimento é interrompido pela adição de um dideoxinucleotídeo (ddNTP) - Usava marcação radioativa, depois fluorescente *Produtos tóxicos e perigosos à saúde, além da dificuldade de automatização, essencial para o sequenciamento de um genoma completo. Prêmio Nobel em Química (1980) Tecnologias para o sequenciamento de DNA Tecnologias de 1ª geração: Frederick Sanger Sequenciamento por Maxam-Gilbert Maxam-Gilbert sequencing 5’ *pGpApTpCpGpGpApCpC 3’ G rxn G+A rxn T+C rxn C rxn G G+A T+C C 3’ *GATCGGACC *GATCGGAC *GATCGGA *GATCGG *GATCG *GATC *GAT *GA *G 5’ 32PGCTACGTA 3’ Cleavage at: A+G G C C+T 32PGCT 32PGCTAC 32PG 32PGCTA 32PGC 32PGCTACGT 32PGCTA 32PGCTACG Sequencing Gel 7 6 5 4 3 2 1 A+G G C C+T A T G C A T C Sequenciamento por Sanger Sequenciamento Sanger Corante Fluorescente Nucleotídeos dNTPs Nucleotídeos ddNTPs (Terminadores) Falta 3’-OH Preparação do DNA Reação de sequenciamento Eletroforese capilar Análise computacional ETAPAS DO SEQUENCIAMENTO DE DNA https://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html ssDNA ddATP ddTTP ddCTP ddGTP electrophoresis reading sequencing gel (slab or capillary gel) ATGC CAGG ACGC TGAT deduced DNA sequence ddCTP ddATP ddGTP ddTTP G A T T C A G C dye-labeled dideoxynucleotides are used to generate DNA fragments of different lengths 120 130 GAT AAAT CT GG TCT T ATT TCC Reação de Sequenciamento DNA Primer Seqüência conhecida Seqüência desconhecida DNA polimerase Terminadores Nucleotídeos Terminadores Nucleotídeos DNA polimerase Desnaturação do DNA calor FITA MOLDE FITA COMPLEMENTAR FITA MOLDE FITA COMPLEMENTAR PRIMER Anelamento dos Primers FITA MOLDE FITA COMPLEMENTAR PRIMER Anelamento dos Primers dGTP dATP dTTP dCTP DNA POLIMERASE PRIMER AGGTCGCATT CGAGTTTC TCCAGCGTAAGCTCAGT FITAMOLDE CAGTCAGATAACGATCAGTCA PRIMER PRIMER FITA MOLDE FITA MOLDE DNA POLIMERASE PRIMER FITA MOLDE DNA POLIMERASE Polimerização ddGTP ddATP ddTTP ddCTP ddGTP ddATP ddTTP ddCTP ddGTP ddATP ddTTP ddCTP °C °C ddGTP ddATP ddGTP ddATP ddTTP ddCTP PRIMER FITA MOLDE ddTTP Terminação ATACCGATAGATCTGACTGACTGAGCTAGACTTAA ABI 3700 Applied Biosystems Eletroforese Capilar Eletroforese capilar LASER LASER Detecção a laser Estudo Dirigido 1. O que é transformação bacteriana? Qual o princípio? Quais as aplicações? 2. Como se faz a seleção de uma bactéria transformada? 3. O que é a PCR? 4. Qual aplicação dessa técnica? 5. Como funciona a reação de sequenciamento Sanger? Leitura Capitulo 11 – Manipulando o gene /Técnicas de Biologia Molecular (páginas 197 a 241) . Menck, C.F.M.; Van Sluys, M.A. Genética Molecular Básica: dos genes aos genomas. Editora Guanabara Koogan, 2017. Capítulo 5 - Técnicas de Genética Molecular (páginas 171- 222). Lodish et al. Biologia Celular e Molecular. 7o Edição. Editora Artmed, 2014.