Slide - Marcadores Moleculares - Uso no Melhoramento - 2023-2

LGN0232 - Genética Molecular Marcadores Moleculares: Uso no Melhoramento e na Conservação Aula 11 Antonio Figueira CENA figueira@cena.usp.br Genética e Melhoramento • Seleção inconsciente e “arte” • da invenção da Agricultura até século XIX • 1900s – (Re)descoberta* dos princípios genéticos de Mendel • 1920-50 - Melhoramento genético científico • Genética quantitativa e biometria (fenótipo é previsor ruim do valor genético!) • 1970-80s em diante – desenvolvimento de marcadores genéticos moleculares * Carl Correns, Erich von Tschermak e Hugo De Vries • Sucesso no melhoramento depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis dos ambientais • Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples • Marcadores genéticos quando associados a características de interesse aumentam a eficiência de seleção marcadores cromossomo Genética e Melhoramento Mapa de local em Piracicaba Mapa de local em Piracicaba “Marcadores” ??? Ex. Marcador bioquímico em sangue Mas o que é um Marcador Genético? • Variação ou polimorfismo que, numa população segregante, se comportam de acordo com as leis Mendelianas! • Baseiam-se na existência de variabilidade genética e na possibilidade de sua detecção • Tipos: • Morfológicos • Bioquímicos (isoenzimas) • Moleculares – DNA (microssatélites, SNPs) Aa x Aa AA Aa aa Mas o que é um Marcador Genético? • Variação ou polimorfismo que, numa população segregante, se comportam de acordo com as leis Mendelianas! • Baseiam-se na existência de variabilidade genética e na possibilidade de sua detecção • Tipos: • Morfológicos • Bioquímicos (isoenzimas) • Moleculares – DNA (microssatélites, SNPs) O ideal seria sequenciar todos os genótipos, mas..... Se usa Marcador Genético Molecular como proxy! Aa x Aa AA Aa aa Drosophila – mapa genético com marcas morfológicas Clockwise, from the top: brown eyes, cinnabar (a shade of deep red), sepia, vermilion (a shade of orange-red), white, and red. The white-eyed fly also has a yellow body Thomas Hunt Morgan Nobel de 1933 Marcadores Morfológicos Chesnokov et al. 2020 (a) mut 25 (sl gene); (b) mut 26 (mc gene); (c) mut 27 (Cu gene); (d) mut 28 (yv, coa, and c genes); (e) mut 34 (mult gene); (f) mut 35 (fa gene); (g) mut 36 (gs gene); (h) mut 38 (u gene) Histórico de Marcadores 1. Karl Sax (1923): propôs método para localização de QTLs ligação entre genes de característica qualitativa (cor de semente) e quantitativa (peso de semente) Problema: ausência de mutações múltiplas em estoques de elite 2. Hunter & Marker (1957): marcas bioquímicas - proteínas desenvolveram isoenzimas em gel de amido 3. Hubby & Lewotin (1966) demonstraram que 30% de loci de isoenzimas exibiam polimorfismo em populações selvagens de Drosophila • Variabilidade observada como resultado da tradução de RNA em proteínas – ex. isoenzimas • Monomorfismo • Polimorfismo Marcadores Bioquímicos 1970s - ferramentas moleculares desenvolvimento de vetores de clonagem; enzimas de restrição; polimerases; ligases; Southern (1977), PCR proposto por Mullis & Faloona (1987) - RFLP proposto por Botstein et al. (1980) descrito para humanos - VNTR por Jeffrey (1987) - RAPD por Rafalski et al. (1990) - SSR (microssatélites) em plantas por Akkaya et al. (1992) - AFLP por Zabeau & Vos (1993) - SNPs em Arabidopsis por Cho et al. (1999) Histórico de Marcadores 1. Mutações pontuais - SNPs A. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ex. Sítio EcoRI B. ATCTCGTGATTATAGTCGTA TAGAGCACTAATATCAGCAT 2. Pequenas inserções e/ou deleções- InDels A. ATCTCGTCTAGTCGTA TAGAGCAGATCAGCAT B. ATCTCGT---GTCGTA TAGAGCA---CAGCAT Origem do Polimorfismo Molecular • Variabilidade surge por mutação, que é o fundamento para identificação de marcadores moleculares • Monomorfismo • Polimorfismo Marcadores Moleculares P1 P2 F1 P1 P2 F1 A A a a P1 P2 A1 A1 A2 A2 P1 P2 150 pb 100 pb 150 pb 100 pb Dominante Codominante Marcadores Dominantes ou Codominantes AA x aa Aa A1A1 x A2A2 A1A2 Origem do polimorfismo Polimorfismos de tamanho: originados por indels (inserções ou deleções) Polimorfismos de base: causados por substituição de bases nitrogenadas Substituição Indel Marcadores Moleculares - SNPs Aplicações de Marcadores no Melhoramento • Mapeamento genômico • Seleção Assistida por Marcadores - MAS • Seleção Genômica - GWAS • Clonagem/Identificação de genes • Diversidade genética e filogenia • Conservação e caracterização de germoplasma • Identificação de acessos • Seleção de genitores para cruzamentos e populações • Filogenia e Evolução Marcadores Moleculares em Uso MICROSSATÉLITES ou SSR Simple Sequence Repeats = SSR Sequências simples repetidas  Pequenas sequências de DNA (1 a 6 nucleotídeos) repetidos em linha (tandem)  Presentes em Eucariotos e Procariotos  Presentes em região codificadora ou não codificadoras  Codominante  Indivíduos heterozigotos são detectados  Multialélicos e amplamente distribuído no genoma  Base genética:  Amplificação de locos específicos de sequências repetitivas  Baseados em PCR com primers específicos MICROSSATÉLITES ou SSR ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN Primer REV Primer FOR Repetição CA/GT Regiões flanqueadoras conservadas MICROSSATÉLITES ou SSR Biblioteca genômica enriquecida com microssatélites MICROSSATÉLITES ou SSR Microsatélites (SSR) (TC)_{15} (AG)_{14} C G C N G A T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T T C T T C T G T T C T 290 310 320 330 340 350 360 368 G T G A C T C T C T C T A G A T C C G N G C A G C C Microsatélites (SSR) Seta: alelos genoma B Musa balbisiana Microssatélites (SSR) Vantagens • Baseiam-se em PCR • Altamente reprodutíveis • Codominantes e multialélicos • Desvantagens • Há necessidade de informações de sequências oriundas de bibliotecas genômicas ou de cDNA • Custo inicial • Baixa saturação Ainda apresenta indicações de uso Microssatélites (SSR) SNP - Single Nucleotide Polymorphism Polimorfismo de base única • Polimorfismo resultante da alteração de uma única base • Abundantes no genoma • Codominante e bialélico • Alta processividade – baixo custo por unidade de dado • Há diversas maneiras de se avaliar a variação: Alinhamento e comparação de sequências • Métodos baseados em chips (arrays) – Infinium, Axiom, GoldenGate,.. • Plataformas de genotipagem (TaqMan, KASP, Fluidigm Dynamic Arrays, LGC KASP, ArrayTape,... . • NGS – sequenciamento do genoma, Genotype-by- Sequencing, RAD-Seq, DArTseq, RESTseq, RESCAN,... SNP Sequenciamento Alinhamento de sequências SNP Thomson 2014 Exemplos de plataforma de genotipagem por SNPs SNP Métodos de NGS para genotipagem 1. Métodos de reduced-representation – redução da complexidade do sequenciamento • Indicado quando ausência de genoma referencia • Uso em genética de populações • Emprega enzimas de restrição para redução da complexidade • Ex. Restriction-site-Associated DNA sequencing (RAD-seq) 2. Baixa cobertura • Uso em estudos de QTL e Marker Assisted Selection • Genotype-by-sequencing (GBS) – baixa cobertura de sequenciamento SNP RADseq Restriction-site Associate DNA Sequencing (RADseq) Population A Population B Genomic DNA Restriction Digestion Size Selection Locus 1 Locus 2 Locus 1 Locus 2 Filtering SNP Site Restriction Site Length 150 350 700 1,300 2,000 3,100 3,500 RRL RAD-seq GBS Digest Ligate adaptors Pool Random shear Size selection Ligate adaptors PCR RRL Sample 1 Sample 2 RAD-seq Sample 1 Sample 2 GBS Sample 1 Sample 2 Reference 150 350 700 1,300 2,000 3,100 3,500 Nature Reviews | Genetics Choudhury et al. (2022) SNP – Genotype by Sequencing SNP em arroz RiceOPA8 RiceOPA8 RiceOPA6 RiceOPA5 RiceOPA3 RiceOPA2 Affymetrix 44K Chr 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 20 30 40 Position(MB) SNP Target Subgroup id5000197 id5000200 id5000204 id5000205 id5000025 id5000209 id5000217 id5000223 IND A A A A IND A A A A IND A A A A IND A A A A IND A A A A IND A A A A IND A A A A AUS C A C A C C T C A C C T C A A G AUS A A C A C C T C A A G AROMATIC G T AROMATIC A A A A A AROMATIC A A A A A AROMATIC A A A A A AROMATIC A A A A A TEJ A A A A A TEJ A A A A A TEJ A A A A A TEJ A A A A A TEJ A A A A A TEJ A A A A Thomson 2014 Example of patterns of informative SNPs within and between subgroups. A subset of the rice 44K SNP data from Zhao et al. 2011 is shown for representative accessions from four subgroups: indica (IND), aus (AUS), aromatic (Aromatic), and temperate japonica (TEJ). Eight SNP loci are shown flanking a gene target, with three SNPs outlined: id5000200 is an example of a SNP mostly monomorphic within subgroups, but polymorphic between indica; the others; ud5000025 is an example of a SNP monomorphic within all groups except for two aus accessions; and id5000223 is segregating within indica and aus, and polymorphic between aromatic and temperate japonica. In practice, the minor allele frequencies (MAF) within and between subgroups will be used as criteria during the SNP selection process. SNP Vantagens: • Abundante no genoma • Cobertura em alta densidade do genoma • Gera muita informação em pouco tempo • Marcador codominante (bialélico) • Desvantagens: • Elevado custo total (mas por dado, é barato) COMPARAÇÃO DOS MARCADORES RAPD AFLP SSR SNP Base genética PCR com primers arbitrários Digestão e PCR com primers seletivos PCR com primers específicos Sequenciamento Tipo de herança Dominante Dominante Codominante Codominante Número de locos Vários Vários Único Único Número de alelos Dois Dois Vários Dois Uso dos Marcadores no Melhoramento de Plantas Aplicações no Melhoramento • Mapeamento genômico • Seleção Assistida por Marcadores - MAS • Seleção Genômica - GWAS • Clonagem/Identificação de genes Construção de Mapas Genéticos Segregação de um loco Segregação de dois locos independentes Genes em cromossomos distintos Mesmo cromossomo mas distantes Khan Academy Construção de Mapas Genéticos crossing over only crossovers happening in this small region can produce Ab or aB chromosomes Recombinant chromosomes do form, but not very often! GENES CLOSE TOGETHER ON THE SAME CHROMOSOME Gametes made: 48% 2% 2% 48% Recombinant Parental Construção de Mapas Genéticos Frequência de Recombinação = recombinantes x 100% no. total Recombinação = 151 + 154 x 100% 1339 + 1195 +151 + 154 Recombinação = 10,7% Mapa genético: representação de ordem e distância entre marcadores genéticos equivalente ao cromossomo Ligação genética • A herança conjunta de diferentes locos se dá por conexão física Construção de Mapas Genéticos Royaert et al. (2016) QTL resistência a vassoura de bruxa do cacaueiro Mapeamento por Associação • Genotipagem de 421 acessos de cacaueiro • Analisaram 27 características • 836 SNPs por GoldenGate Assay Uso de Marcadores Moleculares na Conservação População: um grupo de indivíduos da mesma espécie que potencialmente podem se acasalar, produzindo descendência, e vivem dentro de uma área geográfica restrita no mesmo período de tempo. Empregar marcadores moleculares para definir características das populações de uma espécie para fins de conservação Genética de Populações As espécies em geral não constituem uma única unidade panmítica onde os indivíduos se acasalam aleatoriamente em toda a distribuição da espécie. - Estão subdivididas em entidades menores, que podem organizar-se no espaço, tempo, ecologia, ... - Podem existir diferentes níveis de subdivisão que podem ou não estar hierarquicamente organizados; - As espécies podem estar dividida em grupos ou regiões e estes divididos em unidades menores... até chegarmos a uma unidade básica da população que constitui um grupo homogêneo Genética de Populações Variabilidade genética não estruturada entre populações (uma população) Mesmo nível de variabilidade, mas está organizada entre populações Mesmo nível de variabilidade, mas está organizada entre e dentro das populações Estrutura Genética de Populações Diversidade Genética • A diversidade genética é uma medida da quantidade de variabilidade existente dentro ou entre populações e/ou espécies • Redução na diversidade genética – redução na capacidade de se adaptar a novas pressões seletivas, tais como mudanças climáticas, pragas ou doenças, mudanças na disponibilidade de recursos – aumentando risco de extinção Diversidade Genética • A diversidade genética pode ser medida por índices a partirde de marcadores moleculares: • Número de alelos • Número de locos polimórficos • Heterozigozidade (Fst ou equivalentes: Gst, Rst, fst) • Diversidade haplotípica • Diversidade nucleotídica Diversidade Genética 100 V V 160 V A 140 A A Frequência Fenotípica 260/400 = 0,65 vermelho 140/400 = 0,35 amarelo Frequência Genotípica 100/400 = 0,25 V V 160/400 = 0,40 V A 140/400 = 0,35 A A Frequência alélica 360/800 = 0,45 V 440/800 = 0,55 A Forças que afetam a estruturação genética das populações • Fluxo gênico – troca entre populações (migração ou dispersão) • Deriva genética – mudança na frequência de alelos entre gerações ao acaso • Tamanho efetivo - indivíduos que se reproduzem e conseguem deixar descendentes) • Gargalo genético - redução drástica do tamanho da população, com perda de variabilidade genética • Efeito fundador - estabelecimento de nova população por poucos fundadores originais • Seleção natural – alteração na adaptação • Reprodução – sexuada x assexuada, comportamento e endogamia Estrutura Genética de Populações Importância para estudar a estrutura genética das populações • Conservação Genética: organização da diversidade entre ou dentro das populações • Melhoramento Genético: avaliar a diversidade genética da espécie disponível • Manutenção da Diversidade: estratégias para manter a diversidade da espécie • Fragmentação de Populações: recuperação de ambientes degradados Zucchi M. 2004 High rates of pollen and seed flow in Hymenaea stigonocarpa on a highly fragmented savanna landscape in Brazil Andrea S. Garcia1 · Eduardo A. Bressan1 · Maria Victoria R. Ballester1 · Antonio Figueira1 · Alexandre M. Sebbenn2 Water body Pasturelands Native vegetation Bushy cerrado Adults Juveniles Table 2 Distance of pollen and seed (minimum and maximum) dispersal Pollen dispersal (m) Mean dispersal distance ±2SE 1451 ± 307 Median distance 1356 Range of dispersal distance 1290 to 3578 Minimum seed dispersal (m) 809 ± 224 Maximum seed dispersal (m) 1725 ± 308 46.53 47.65 45.81 48.55 46.51 Distance (km) 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 3.25 3.5 3.75 4 Frequency Minimum seed Maximum seed Pollen Adults Juveniles Por que usar marcadores? Fornece informações a respeito de: • Diversidade genética • Endogamia e sistemas de cruzamento • Fluxo gênico • Paternidade • Sexagem Auxilia na definição de estratégias de manejo e conservação Ajuda a organizar coleções de germoplasma Estudo Dirigido 1. O que são marcadores moleculares? 2. Definir marcadores moleculares. 3. O que são marcadores dominantes e codominantes? 5. Quais os tipos de marcadores moleculares? 6. Qual a utilidade de marcadores moleculares no mapeamento genético? 7. Qual a utilidade de marcadores moleculares nos estudos de diversidade genética e conservação das espécies?