Slide - Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão - 2023-2

LGN0232 - Genética Molecular Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão –TIMPs CRISPR & RNAi Antonio Figueira CENA figueira@cena.usp.br Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão - TIMPs • Definições de Organismos Geneticamente Modificados e Transgenia • Protocolo de Cartagena de Biossegurança define LMO como ‘‘any living organism that possesses a novel combination of genetic material obtained through the use of modern biotechnology.” –– Living Modified Organism • Novas metodologias ou abordagens que resultam na AUSÊNCIA de DNA/RNA recombinante no produto final Todo Organismo Geneticamente Modificado (OGM) é um Transgênico? Quem controla a liberação de Organismos Geneticamente Modificados? Eles são seguros? Foto: Paulo Barroso http://ctnbio.mctic.gov.br/inicio CTNBIO Liberações Comerciais Liberações Comerciais Última atualização 10/06/15 10:51 6 Subpastas 0 Documentos Subpastas Vacinas Subpastas: Parecer Técnico nº 099-2004, Parecer Técnico nº 1300-2008, Parecer Técnico nº 1427-2008, Parecer Técnico nº 1591-2008, Parecer Técnico nº 2146-2009, Mais » Plantas Plantas Subpastas: Algodão, Cana, Eucalipto, Farinha de Trigo, Feijão, Mais » Outros Subpastas: Parecer Técnico - Farinha de Trigo GM, Parecer Técnico nº - 5496 - 2017, Parecer Técnico nº 261-470_2004 - Importação e Liberação Comercial de Enzimas - Processo 01200.00374, Parecer Técnico nº 3964 - 2014 - OX513A de Aedes aegypti, Parecer Técnico nº 5827 - 2018, Mais » Microorganismos Subpastas: Parecer Técnico nº 2281 - 2010, Parecer Técnico nº 3287 - 2012, Parecer Técnico nº 3775 - 2013, Parecer Técnico nº 3877 - 2013, Parecer Técnico nº 4203 - 2014, Mais » English Version Subpastas: Crops, Microorganisms, Others, Vaccines Animais Animais Subpastas: Salmão, Tabela de Animais - Uso Comercial Mostrando 6 resultados. Itens por página 50 Página 1 de 1 Primeiro Anterior Próximo Último Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão Alguns mecanismos de defesa de bactérias inatos … E o CRISPR-Cas? …14 repeats of 29 base pairs (bp) that were interspersed by 32–33 bp non-repeating spacer sequences…. CRISPR–Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – CRISPR-associated proteins Cas) -> módulos = sistema adaptativos de imunidade presente em muitas arqueias e bactérias Definição de CRISPR CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) + Cas (CRISPR-associated) https://www.cell.com/fulltext/S0092-8674%2815%2901705-5 Trabalho pioneiro sobre CRISPR/Cas.... Molecular Microbiology (1993) 9(3), 613-621 Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites F. J. M. Mojica, G. Juez and F. Rodríguez-Valera* Departamento de Genética Molecular y Microbiología, Apartado 374, Universidad de Alicante, 03080 Alicante, Spain. Summary Two genomic sequences from the halophilic archaeon Haloferax mediterranei, where we had found PstI restriction-pattern modifications depending on the salinity of the growth medium, have been studied. A markedly salt-dependent differential expression has been detected in the nearby regions. Two of the open reading frames characterized correspond to two of the differentially expressed transcripts. In both cases the PstI sites were sites of purine–pyrimidine alternancies suggestive of Z-DNA structures and located in non-coding regions with frequent repetitive motifs. A long alternating adenine–thymine tract also appears in the upstream regions of one of these open reading frames. A possible role of local DNA configuration in osmoregulation in this organism is discussed. Ensaio com Streptococcus thermophilus Science 2007 315,1709-1712 Definiram função de CRISPR CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) + Cas (CRISPR-associated) Sistema Imune Adaptativo CRISPR–Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – CRISPR-associated proteins Cas) = módulos são sistema adaptativos de imunidade presente em muitas arquéias e bactérias Definição de CRISPR PRÊMIO NOBEL DE QUIMICA EM 2020 Streptococcus pyogenes Science 337, 816-821 DOI: 10.1126/science.1225829 Otimização do Sistema Crispr-Cas9 crRNA + tracRNA -> sgRNA doi: 10.1016/j.biotechadv.2014.12.006 CRISPR RNA (crRNA) trans-acting CRISPR RNA (tracrRNA) Protospacer Adjacent Motif (PAM) CRISPR em Mamíferos e Humanos em 2013 Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems Le Cong, 1,2 * F. Ann Ran, 1,4 * David Cox, 1,2 Shuaifling Lin, 1,3 Robert Barretto, 1 Naomi Habib, 4 Patrick D. Hsu, 1,4 Xuebing Wu, 2 Wenyuan Jiang, 3 Luciano A. Marraflni, 6 Feng Zhang 1 † Functional elucidation of causal variants and elements requires precise genome editing technologies. The type II prokaryotic CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/bas9 adaptive immune system has been shown to facilitate RNA-guided site-specific DNA cleavage. We engineered two different type II CRISPR/cas systems and demonstrate that cas9 nucleases can be directed by short RNAs to induce precise cleavage at endogenous genomic loci in human and mouse cells. Cas9 can also be converted into a nickase enzyme to facilitate homology-directed repair with minimal mutagenic activity. Lastly, multiple guide sequences can be encoded into a single CRISPR array to enable simultaneous editing of several sites within the mammalian genome, demonstrating easy programmability and wide applicability of the RNA-guided nuclease technology. The Streptococcus pyogenes SF370 type II CRISPR locus consists of four genes, including the Cas9 nuclease, as well as two noncoding CRISPR RNAs (crRNAs): trans-activating crRNA (tracrRNA) and a precursor crRNA (pre-crRNA) array containing inactive guide sequences (spacers) interspaced by identical direct repeats (DRs) (fig. S1) (9). We sought to harness this prokaryotic... https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) + Cas (CRISPR-associated) CRISPR-Cas9 https://www.youtube.com/watch?v=MnYppmstxIs SISTEMAs DE RECOMBINAÇÃO – em CRISPR/Cas Doi: 10.1016/j.biotechadv.2014.12.006 HR = homologous recombination (troca de informação genética entre moléculas de DNA com sequências similares) NHEJ = Non-homologous end joining (a introdução de inserções ou deleções na sequencia alvo) https://www.youtube.com/watch?v=47pkFey3CZ0 https://www.youtube.com/watch?v=TdBAHexVYzc Edição Genômica – CRISPR/Cas9 https://www.nature.com/articles/495050a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat = CRISPR CRISPR- associated = Cas Bitter fight over CRISPR patent heats up Unusual battle among academic institutions holds key to gene-editing tool’s future use. BY HEIDI LEDFORD A versatile technique for editing genomes has been called the biggest biotechnology advance since the polymerase chain reaction (PCR), and the US Patent and Trademark Office (USPTO) is set to determine who will reap the rewards. On 11 January, the USPTO granted a request to review a key patent awarded for the technique, known as CRISPR–Cas9. The outcome of the ensuing proceedings, called a patent interference, could be worth millions to the research institutions that are at war over the relevant patents. It might also influence who is allowed to use the technology — and under what terms. “This is an absolutely humongous biotech patent dispute,” says legal scholar Jacob Sherkow of New York Law School. “We’re all waiting with bated breath.” CRISPR–Cas9 is a bacterial defence system that uses the enzyme Cas9 to snip DNA at institutions usually come to an agreement to share rights to the invention. “This seems more bitter than disputes I’ve heard of in the past,” she adds. The two patents in question make broad claims to ‘foundational’ intellectual property thought to be necessary for most lucrative CRISPR–Cas9 applications. But many patents have been filed on CRISPR–Cas9 technologies, and there is still the chance that the winner of the interference will face additional challenges in court. Zhang’s group has also reported another enzyme, called Cpf1, that functions in a similar way to Cas9. Researchers expect other alternatives to emerge with time. LICENSING LOOMS For now, it is unclear how the dispute will affect researchers who use CRISPR–Cas9, if it affects them at all. “Patent holders might send out a few cease-and-desist letters, but they probably won’t sue academic researchers,” says Rodney Sparks, a biotechnology-patent... Exemplo de vetor binário (plasmídeo) para CRISPR/Cas em plantas https://www.addgene.org/91145/ CRISPR Em tomato, pelo menos 6 loci são chaves para características de domesticação: hábito de crescimento da planta (SELF- PRUNING), forma do fruto (OVATE) e tamanho do fruto (FASCIATED e FRUIT WEIGHT 2.2), número de frutos (MULTIFLORA), e qualidade nutricional (LYCOPENE BETA CYCLASE). Science 2 August 2019 sciencemag.org CHINA’S CRISPR HARVEST National genome-editing push targets crops and animals EXCLUSIVE: Inside the embryo-editing scandal p. 420 02/08/2019 CRISPR na China Invention inventory In a recent analysis of more than 2000 patent applications for distinct inventions that involved CRISPR, the United States barely edged out China. Applications from China have climbed rapidly in recent years, and the country dominates in the agricultural and industrial realms. Publicly available CRISPR patent applications as of December 2018 United States 872 China 858 Europe 186 Technical improvements Medical applications Agricultural applications Industrial applications Other ...but lags in citations U.S. authors dominated citations to CRISPR studies from 2012 to 2018. In 2017, 15 of the 20 most cited papers had U.S. lead authors. Only China’s plant scientist Gao Caixia (see p. 422) cracked that list. China catches up in papers U.S. researchers in many subfields publish the most CRISPR-related papers, but China is catching up, according to PubMed data analyzed for Science by computational biologist Geoffrey Siwo of the University of Notre Dame in South Bend, Indiana. United States (2967 total papers) China (2059 total papers) Japan Germany Other countries Number of papers for 2018 986 United States 824 China 229 Japan 167 Germany 112 United Kingdom 130 Other countries 56 Australia 50 India 26 Belgium 24 Singapore 23 France 22 Israel 22 Italy 20 Iran 17 Russia 17 Pakistan 16 Austria 14 Norway Planting a flag Among 52 CRISPR publications on improving traits in agricultural crops, published between 2004 and 2017, China accounted for 42% of them. China 22 United States 10 Europe Japan Israel India South Korea Turkey Saudi Arabia Philippines CRISPR/Cas Genome Editing and Precision Plant Breeding in Agriculture Comparação de Métodos de Melhoramento Comissão Técnica Nacional de Biossegurança MINISTÉRIO DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA, INOVAÇÕES E COMUNICAÇÕES INSTITUCIONAL A CTNBio Secretaria Executiva Processo de OGM Reuniões Atas NORMAS E LEIS RESOLUÇÕES NORMATIVAS Resolução Nº 18, de 23 de março de 2018 Republica a Resolução Normativa nº 2, de 27 de novembro de 2006, que “Dispõe sobre a classificação de riscos de Organismos Geneticamente Modificados (OGM) e os níveis de biossegurança a serem… Leia mais » Resolução Normativa Nº 16, de 15 de janeiro de 2018 Estabelece os requisitos técnicos para apresentação de consulta à CTNBio sobre as Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão A COMISSÃO TÉCNICA NACIONAL DE… Leia mais » Serviços da CTNBio Perguntas Frequentes Contato Acessibilidade Alto Contraste Mapa do Site Português English Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão - TIMPs • Regulações de biossegurança devem se basear em conhecimentos científicos • Para commodities – regulamentos comuns aceitos por diversos países • MAS, a abordagem regulatória para TIMPs varia entre países • A edição de genoma utiliza várias abordagens: • Deleção ou inserção dirigida, substituição de alelo, conversão de bases... • Regulação de biossegurança de OGMs é baseada em método e não em produto ou seus riscos potenciais! • A introdução de TIMPs, particularmente a edição genômica, trouxe novos desafios regulatórios!! 24/09/2020 Resolução Normativa Nº 16, de 15 de janeiro de 2018 - CTNBio Resolução Normativa Nº 16, de 15 de janeiro de 2018 Estabelece os requisitos técnicos para apresentação de consulta à CTNBio sobre as Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão A COMISSÃO TÉCNICA NACIONAL DE BIOSSEGURANÇA – CTNBio, no uso de suas atribuições legais e regulamentares e em observância às disposições contidas nos incisos XV e XVI do art. 14 da Lei nº 11.105, de 24 de março de 2005, CONSIDERANDO a necessidade de avaliar as Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão (TIMP), do inglês Precision Breeding Innovation (PBI) que também encontram-se denominadas Novas Tecnologias de Melhoramento, do inglês New Breeding Technologies - NBTs, à luz dos preceitos previstos na Lei nº 11.105, de 24 de março de 2005; Considerando que a Lei nº 11.105, de 2005, define modalidades de ADN/ARN recombinante, engenharia genética e organismo geneticamente modificado – OGM nos incisos III, IV e V de seu art. 3º, respectivamente; Considerando ainda que as TIMP abrangem um conjunto de novas metodologias e abordagens que diferem da estratégia de engenharia genética por transgênica, por resultar na ausência de ADN/ARN recombinante no produto final; Considerando que as TIMP podem introduzir usos inovadores de ferramentas de biologia molecular, que podem resultar: 1. Na edição precisa de genomas, por indução de mutações específicas, gerando ou modificando alelos selvagens ou mutados sem inserção de transgênse; 2. Em transformação genética ou controle de expressão gênica (ativação/inativação); 3. Em regulação epigenética da expressão de genes por mecanismos que não envolvem modificação genômica no indivíduo; 4. Em transformação genética que envolve controle de expressão gênica de genes específicos sexualmente compatíveis; 5. Em transformação genética temporária e não hereditável de células e tecidos; 6. Em infecção permanente ou não do hospedeiro de elementos virais transformados geneticamente; 7. Na criação de novos alelos com alteração permanente e potencial recombinogênico com possibilidade de alterar toda uma população (direcionamento gênico, do inglês: gene drive); e 8. Na construção de genes heterólogos ou novas cópias de genes homólogos. Resolve: Art. 1º São considerados exemplos de Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão (TIMP), mas não limitadas a estas, as tecnologias descritas no Anexo I integrante desta Resolução Normativa, que podem originar um produto não considerado como um Organismo Geneticamente Modificado (OGM) e seus derivados, conforme definições da Lei nº 11.105, de 24 de março de 2005. § 1º O produto a que se refere o caput deste artigo é definido como a descendência, linhagem ou o produto final de um processo que utiliza Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão em uma ou mais de suas fases de desenvolvimento. § 2º Os casos a serem enquadrados não se limitam às tecnologias descritas no Anexo I, uma vez que o avanço rápido e contínuo de diferentes tecnologias poderá propiciar novos produtos, aos quais os preceitos desta Resolução Normativa serão igualmente aplicáveis. § 3º Os produtos a que se refere o caput deste artigo implicam, pelo menos, em uma das seguintes características: I - produto com ausência comprovada de ADN/ARN recombinante, obtido por técnica que emprega OGM como parental; II - produto obtido por técnica que usa ADN/ARN que não se multiplicará em célula viva; III - produto obtido por técnica que introduz mutações sítio dirigidas, gerando ganho ou perda de função gênica, com a ausência comprovada de ADN/ARN recombinante no produto; IV - produto obtido por técnica onde existe a expressão, temporária ou permanente, de moléculas de ADN/ARN recombinante, sem que haja a presença ou introgressão dessas moléculas no produto; e V - produto onde são utilizadas técnicas que empregam moléculas de ADN/ARN que, absorvidas ou não de forma sistêmica, não causam modificação permanente do genoma. Parágrafo único. No caso de um produto obtido a partir de um OGM com parecer favorável da CTNBio para liberação comercial, as condições descritas serão aplicáveis somente à característica introduzida por TIMP. 24/09/2020 Resolução Normativa Nº 16, de 15 de janeiro de 2018 - CTNBio Estabelece os requisitos técnicos para apresentação de consulta à CTNBio sobre as Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão A COMISSÃO TÉCNICA NACIO CONSIDERANDO a necessidade de avaliar as Considerando que a Lei nº 11. Considerando que as TIMP ab Art. 1º São considerados exemp Tecnologias descritas no Ane § 1º O produto a que se refere § 2º Os casos a serem enquadra § 3º Os produtos a que se ref I – produto com ausência com II – produto obtido por técni III – produto obtido por téc IV – produto obtido por ténic V – produto onde são utiliz Parágrafo único. No caso de um • ...Art. 1º São considerados exemplos de Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão (TIMP), mas não limitadas a estas, as tecnologias descritas no Anexo I integrante desta Resolução Normativa, que podem originar um produto não considerado como um Organismo Geneticamente Modificado (OGM) e seus derivados, conforme definições da Lei nº 11.105, de 24 de março de 2005... ... • 5. TÉCNICA: Mutagênese Sítio Dirigida. • 5.1 RESUMO DA TÉCNICA: Complexos proteicos ou riboproteicos capazes de causar mutagênese sítio dirigida em microrganismos, plantas, animais e células humanas.... ... • 8. TÉCNICA: RNAi uso tópico/sistêmico. • 8.1 RESUMO DA TÉCNICA: Uso de RNA fita dupla ("dsRNA") com sequência homóloga ao(s) gene(s) alvo para silenciamento específico desse(s) gene(s). As moléculas engenheiradas de dsRNA podem ser introduzidas/absorvidas pela célula a partir do ambiente.... TIMPS – ANEXO I Transgenic Res (2021) 30:551–584 https://doi.org/10.1007/s11248-021-00257-8 GENOME EDITING IN PLANTS Regulatory approaches for genome edited agricultural plants in select countries and jurisdictions around the world Jon Entine · Maria Suele S. Felipe · Jan-Hendrik Groenewald · Drew L. Kershen · Martin Lema · Alan McHughen · Alexandre Lima Nepomuceno · Ryo Ohsawa · Reynalte L. Ordoño · Wayne A. Parrott · Hector Quemada · Carl Ramage · Inez Slamet-Loedin · Stuart J. Smyth · Diane Wray-Cahen Produced through Modern Biotechnology? 2. With novel combination? GMO (Classic) NBT (Case 2) NBT (Case 1) HGT CBT rDNA technology with trans insert; Direct injection; Fusion of unrelated cells SDN3 with trans insert*; Agroinoculation of germline tissues with trans insert; Synthetic genomics ** (trans-like sequence integration)*** Site-directed Nuclease 1 (SDN1); SDN2**; SDN3 with cis insert*; Grafting with GM material; Oligonucleotide-directed mutagenesis (ODM); Cisgenesis and Intragenesis; RNA-dependent DNA methylation (RdDM); Reverse Breeding; Agroinoculation of non-germline tissues; Agroinoculation of germline tissue with cis insert; Synthetic Genomics ** (cis-like sequence integration or faithful genome reconstruction)*** Regulation for Non-GM/Conventional Products which are assumed to be safe (e.g. Codex Alimentarius) Natural genetic transformation of some plants through horizontal gene transfer (HGT) by some bacteria and viruses Mutagenesis (chemical, physical, transposon, retrotransposon); Hybrid breeding; Wide hybridization Tissue culture; Fusion of related cells; Etc. GM Regulation *Includes insertion using the new CRISPR-CAS with Prime Editing (Anzalone et al, 2019) **Not to be confused with Synthetic Biology, which specializes on sequences/genetic elements (e.g. unnatural base pairs) in the genome that are not found in nature (beyond novel combination). ***Pertains to a largely synthetic assembled genome. Regulação de edição de genoma para uso comercial New Phytologist, First published: 23 June 2022, DOI: (10.1111/nph.18333) CRISPR – liberação Europa 22/02/17 29/01/18 CRISPR – liberação Europa 02/08/2018 21/04/2016 • ...Art. 1º São considerados exemplos de Técnicas Inovadoras de Melhoramento de Precisão (TIMP), mas não limitadas a estas, as tecnologias descritas no Anexo I integrante desta Resolução Normativa, que podem originar um produto não considerado como um Organismo Geneticamente Modificado (OGM) e seus derivados, conforme definições da Lei nº 11.105, de 24 de março de 2005... ... • 5. TÉCNICA: Mutagênese Sítio Dirigida. • 5.1 RESUMO DA TÉCNICA: Complexos proteicos ou riboproteicos capazes de causar mutagênese sítio dirigida em microrganismos, plantas, animais e células humanas.... ... • 8. TÉCNICA: RNAi uso tópico/sistêmico. • 8.1 RESUMO DA TÉCNICA: Uso de RNA fita dupla ("dsRNA") com sequência homóloga ao(s) gene(s) alvo para silenciamento específico desse(s) gene(s). As moléculas engenheiradas de dsRNA podem ser introduzidas/absorvidas pela célula a partir do ambiente.... TIMPS – ANEXO I Flavr Savr (Calgene) O tomate Flavr Savr foi desenvolvido pela Calgene, Davis, Califórnia. Baseado na inserção de gene da enzima poligalacturonase (degrada componentes da pectina) no sentido anti-senso!! O FDA não exigiu aprovação para liberação, no entanto a Calgene submeteu voluntariamente o Flavr Savr para aprovação em 1989. Em 1994, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos aprovou por que este não apresentava risco ao ambiente. 1990s - uso de RNA antisenso • 1990: CHS/DFR em petúnias • Cossupressão....post-transcriptional inhibition of gene expression • 1992: ALB-1 e ALB-3 em Neurospora crassa – não transcritos • “Quelling” Cossupressão em outros organismos • C. elegans: PAR-1 (Guo & Kemphues, 1995) • Drosophila: Adh-1 (Pal-Badhra et al., 1997) JOURNAL OF AGRICULTURAL RESEARCH Vol. 37 Washington, D. C., August 1, 1928 No. 3 HOSTS AND SYMPTOMS OF RING SPOT, A VIRUS DISEASE OF PLANTS¹ By S. A. Wingard² Associate Plant Pathologist, Virginia Agricultural Experiment Station INTRODUCTION insight review articles RNA silencing in plants David Baulcombe The Sainsbury Laboratory, John Innes Centre, Colney Lane, Norwich NR4 7UH, UK (e-mail: david.baulcombe@sainsbury-laboratory.ac.uk) There are at least three RNA silencing pathways for silencing specific genes in plants. In these pathways, silencing signals can be amplified and transmitted between cells, and may even be self-regulated by feedback mechanisms. Diverse biological roles of these pathways have been established, including defence against viruses, regulation of gene expression and the condensation of chromatin into heterochromatin. We are now in a good position to investigate the full extent of this functional diversity in genetic and epigenetic mechanisms of genome control. Although RNA silencing has only emerged as a topic of general interest in the past six years, the first RNA silencing paper may have been published as long ago as 1928. In that paper Wingard described tobacco plants in which only the initially infected leaves were necrotic and diseased owing to 'tobacco ringspot virus' (Fig. 1). The upper leaves had somehow become immune to the virus and consequently were asymptomatic and resistant to secondary infection. At the time this 'recovery' was a mystery: there was no obvious way to explain the specificity of the resistance to secondary infection. Baulcombe 2004. Nature 431, 356–363 • 1997: defesa contra vírus em plantas por inserção de sequencia viral (proteína da capa proteína ou outro gene) • Similar a silenciamento gênico • 1998: injeção de dsRNA silencia gene de músculo unc-22 em C. elegans • dsRNA >>> RNA fita senso ou antisenso • Sistêmico e sinal amplificado Craig Mello Andrew Fire Prêmio Nobel de Medicina / Fisiologia 2006 • 1998: ingestão de E. coli expressando dsRNA por C. elegans leva a RNAi Timmons et al. 2001 Gene. Timmons & Fire 1998 T7 T7 Silenciamento Gênico em Plantas Silenciamento gênico em plantas derivou evolutivamente: - Defesa contra infecção por vírus (RNA ou DNA) - Controle de expressão gênica - Proteção do genoma de transposons - cromatina 2007: Demonstração de controle por transgenia - Ingestão 1. Introdução de dsRNA (RNA dupla-fita longo) 2. Digestão por enzima Dicer (RNAse III) 3. Fragmentos ~19-25 nt - siRNA ‘fita guia’ (antissenso) e ‘passageira’ (senso) -> degradada 4. RNA-induced Silencing Complex = RISC 5. ‘RISC-fita guia’ identifica mRNA alvo 6. Degradação do mRNA – AGO slicer 7. Amplificação – RdRP (RNA-dependent RNA Polymerase) Singh et al. 2015. DOI: 10.5772/61760 RdRP Dicer RISC • HIGS: Host-Induced Gene Silencing • Plantas são transformadas com construções que são transcritas em grampo (hairpin) e processados pela maquinaria da planta ou do organismo alvo como siRNA hairpin Processados pela Dicer transcrição dsRNAs transcrito Transgene - DNA Toxicidade de dsRNA DvSnf7 a larva de Diabrotica virgifera virgifera) SNF7 – Sucrose Non-Fermenting Membro do complexo ESCRT-III endosomal sorting complex required for transport https://www.rnai-technology.com/ dvsnf7 – dsRNA – 240 pb Diabrotica virgifera virgifera • Limitações de HIGS: • Limitações de obter transgenia; nível de expressão; processamento pelo hospedeiro; regulamentação; ... • Uso de aplicação direta de dsRNA – Spray-Induced Gene Silencing (SIGS) • Aplicação de dsRNA por meio de microorganismos • Expressão em E. coli, levedura, endofíticos • Biopesticidas Primeiro produto comercial derivado de dsRNA (proteasome subunit b5) Ledprona (Calantha) GreenLight Biosciences Rodrigues et al., 2021 ESTUDO DIRIGIDO 1 Resolução Normativa 16 2. Técnicas Inovadoras de Melhoramento 3. Componentes de CRISPR/Cas 4. Considerações de Biossegurança de CRISPR 5. Aplicação do CRISPR-Cas9 Leitura recomendada https://innovativegenomics.org/crisprpedia/