Aula 5 - Estudos das ômicas

Microbioma - Aplicações Linking Long-Term Dietary Patterns with Gut Microbial Enterotypes Gary D. Wu,1,2 Jun Chen,2,3 Christian Hoffmann,4,5 Kyle Bittinger,4 Ying-Yu Chen,1 Sue A. Keilbaugh,1 Meenakshi Bewtra,1,2 Dan Knights,6 William A. Walters,7 Rob Knight,8,9 Rohini Sinha,4 Erin Gilroy,2 Kernika Gupta,10 Robert Baldassano,10 Lisa Nessel,2 Hongzhe Li,2,3 Frederic D. Bushman,4* James D. Lewis1,2,3* www.sciencemag.org SCIENCE VOL 334 7 OCTOBER 2011 ORIGINAL ARTICLE Saliva microbiomes distinguish caries-active from healthy human populations Fang Yang1, Xiaowei Zeng2, Kang Ning2, Kuan-Liang Liu3, Chien-Chi Lo3, Wei Wang2, Jie Chen2, Dongmei Wang2, Ranran Huang2, Xingzhi Chang3, Patrick S Chain3, Gary Xie3, Junqi Ling1 and Jian Xu2* 1Department of Operative Dentistry and Endodontics, Guanghua School and Hospital of Stomatology and Institute of Stomatological Research, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong, China; 2Chinese Academy of Sciences, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Qingdao, Shandong, China and 3OraGen, B-6, Bioscience Division, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, USA Sequenciamento Sanger Relembrando Sanger... Dogma Central da Biologia Molecular Genoma Transcriptoma Proteoma O que seria Ômica? O que seria Ômica? Todos os constituintes considerados coletivamente Gene – Genoma (Genomic) Transcrito – Transcritoma (Transcriptomic) Proteína – Proteoma (Proteomic) ... Estonian Biocentre O que seriam Ômicas? E há mais: epigenoma, lipidoma, interatoma, fluxoma, etc… Name Genomics Genomics Epigenomics Transcriptomics Transcriptomics 1 ncRNAomics Proteomics Proteomics Phosphoproteomics Localziomics 2 Fluxomics 2 Interactomics 2 Structural Proteomics Metabolomics Metabolomics Lipidomics Aminomics Others Glycomics Cytomics Populomics Exposomics Target Genes (DNA sequence) Modification of DNA and DNA-binding proteins mRNA non-coding RNA (including microRNA) Proteins Protein phosphorylation Protein localization Protein flux Protein-protein interaction Protein structure Metabolites Lipids Amino acids Sugar chains Cells Human population Environmental exposure 3 Four major categories and their subcategories are shown. 1 Transcriptomics can be regarded as a subcategory of genomics. 2 Corresponding omics of metabolites can also be the targets. In addition, omics analysis of protein-metabolite interaction may be possible. 3 Borrell, 2011 Avanços tecnológicos recentes permitiram o surgimento da Era das Ômicas FENÓTIPO Ambiente Avanços tecnológicos recentes permitiram o surgimento da Era das Ômicas FENÓTIPO Ambiente conjunto de todas as características observáveis – que são influenciadas tanto por seu genótipo quanto pelo ambiente Em um organismo, somente o genoma permanece constante, independente do estágio de desenvolvimento, tecido e ou condição ambiental! Diferentes estímulos podem afetar diretamente o transcritoma, o proteoma e o metaboloma. Genoma: toda a informação hereditária de um organismo que está codificada em seu DNA (ou, em alguns vírus no RNA). Isto inclui tanto os genes como as sequências não-codificadoras e regiões regulatórias. Transcritoma: conjunto completo de transcritos (RNAs mensageiros, RNAs ribossômicos, RNAs transportadores e os microRNAs) de um dado organismo, órgão, tecido ou linhagem celular. Portanto, é o reflexo direto da expressão dos genes. Proteoma: conjunto de todas as proteínas em uma célula, organela fluido biológico, tecido ou organismo em um dada condição biológica Metaboloma: conjunto de todos os metabólitos em uma célula, fluido biológico, tecido ou organismo em dada condição biológica Definindo Conceitos constituintes coletivamente Primários Secundários DNA e RNA 1- O que são? 2- Qual a estrutura? São ácidos nucléicos, encontrados em todas as células. Estão envolvidos na transmissão de caracteres hereditários e na produção de proteínas Proteínas 1- O que são? 2- Qual a estrutura? São moléculas orgânicas de estrutura complexa e Massa Molecular elevada. São sintetizads pelos organismos vivos através de ligações peptídicas covalentes entre aminoácidos. Funções: enzimas, anticorpos, componentes estruturais Metabólitos 1- O que são? 2- Qual a estrutura? Metabólitos são os intermediários (substratos, cofatores) e produtos do metabolismo! Ciclo de Calvin Carboidratos Álcoois Aminoácidos Ácidos orgânicos Lipídios 4 Bases 20 Amino ácidos 2x105 metabólitos Metabolômica Proteômica Genômica/ transcritômica Diversidade Química A pirâmide da vida Dificuldades do estudos de Ômicas Vamos estudar somente como obter informação das 4 bases! Como estudar o Genoma e o Transcritoma? Visão Histórica e a Atual Sequenciamento de DNA e RNA Biblioteca Genômica: coleção de clones de DNA representando o genoma de um organismo Biblioteca de cDNA: coleção de clones com insertos de DNA complementar (cDNA), sintetizados a partir de moléculas de mRNA de uma amostra (condição biológica) Método clássico – sequenciamento Sanger: Bibliotecas Genômicas DNA de interesse Clivar com Enzima de Restrição Fragmentos de DNA Fragmentos inseridos em Plasmídeos usando Ligase Moléculas de DNA recombinante Introdução dos Plasmídeos nas Bactérias Biblioteca genômica Construção de Bibliotecas Genômicas Esquema básico para construção de uma biblioteca genômica Biblioteca Genômica de DNA DNA genômico Extração de DNA vetores plasmidiais disgestão com enzimas de restrição célula DNA fragmentado Vetores clivados ligaçào com DNA ligase inserção em bactérias DNA Coleção de DNA genômico (Biblioteca) Biblioteca Genômica de DNA DNA genômico Extração de DNA vetores plasmidiais disgestão com enzimas de restrição célula DNA fragmentado Vetores clivados ligaçào com DNA ligase inserção em bactérias DNA Coleção de DNA genômico (Biblioteca) 1. Extração de DNA 2. Fragmentação do DNA 3. Ligação em vetores 4. Inserção em bactérias 5. Multiplicação (clones) Etapas: Construção de Bibliotecas Genômicas 1 plasmídeo 1 célula Transformação Plasmídeo recombinante Enzima de restrição Enzima de restrição DNA cromossômico Gene alvo DNA Recombinante Transformação Célula hospedeira Juang RH (2004) BCbasics Plasmídeo Construção de Bibliotecas Genômicas 1 célula, 1 colônia Duplicação do plasmídeo Duplicação da bactéria Plaquear Isolar a colônia com o gene de interesse Juang RH (2004) BCbasics Construção de Bibliotecas Genômicas Fragmentos de DNA sequenciados Fragmentos Completos Biblioteca de insertos pequenos Montagem dos fragmentos Fechamento dos gaps Análise Bibliotecas de cDNA Construção de Bibliotecas de cDNA cDNA : DNA sintetizado a partir do mRNA usando a enzima transcriptase reversa. mRNA DNA Vetor E. coli *cDNA: DNA complementar ao mRNA mRNA Cauda poli (A) Primer oligo (dT) Síntese da primeira fita de DNA pela transcriptase reversa Ribonuclease H degrada o RNA Síntese da segunda fita de DNA pela DNA polimerase I Finalização da síntese da segunda fita de DNA RNA DNA SÍNTESE DE cDNA Esquema básico para construção de uma biblioteca de cDNA CRIANDO UMA BIBLIOTECA DE cDNA 1. Isolamento de mRNAs das células 2. Uso da transcriptase reversa para sintetizar a fita complementas ao mRNA. Uso da DNA polimerase para sintetizar a dupla fita (cDNA). 3. Inserção do cDNA em vetores e introdução em células. Biblioteca de cDNA Coleção de cDNAs em bibliotecas, representadas por DNA provindo de cada gene expresso CRIANDO UMA BIBLIOTECA DE cDNA 1. Isolamento de mRNAs das células 2. Uso da transcriptase reversa para sintetizar a fita complementas ao mRNA. Uso da DNA polimerase para sintetizar a dupla fita (cDNA). 3. Inserção do cDNA em vetores e introdução em células. Biblioteca de cDNA Coleção de cDNAs em bibliotecas, representadas por DNA provindo de cada gene expresso Vantagem: somente os genes expressos são selecionados (clonados)! 1. Extração de mRNA 2. Síntese de cDNA 3. Ligação em vetores 4. Inserção em bactérias 5. Multiplicação (clones) Etapas: Construção de Bibliotecas de cDNA Sequenciamento de ‘Nova Geração’ NGS Tecnologia de primeira geração Tecnologias de segunda geração Custo de Sequenciamento Ciência Rural, Santa Maria, v.40, n.3, p.735-744, mar, 2010 ISSN 0103-8478 Sequenciamento de DNA de nova geração e suas aplicações na genômica de plantas Tabela 1 - Resumo das principais características técnicas das plataformas 454 GS-FLX, Solexa e SOLiD e laboratórios no Brasil que já adquiriram essas novas plataformas. A duração da corrida inclui o tempo para o preparo, a leitura e o processamento das amostras; o custo da corrida e o valor do equipamento são fornecidos na capacidade máxima do equipamento. -----------------Corrida------------------ ----------------Custo--------------- Plataforma Informação (Gb) Duração (dias) Reads (pb) Equipamento (US) Base (US) Acurácia (%) Laboratório** GS-FLX Titanium 0,5 3 a 4 Até 400 531.500 10.000 99,5 - LNCC - IQ-USP Genome analyzer (Solexa) 3 5 25-35 430.000 6.250 98,5 - Nenhum SOLiD System 25 4-12 35-50 599.000 10.000 99 - Fiocruz - Instituto Ludwig - UFPA https://www.genome.gov/sequencingcostsdata Custo de Sequenciamento por Megabases de DNA Lei de Moore: dobrar a capacidade de processamento https://www.genome.gov/sequencingcostsdata Custo de Sequenciamento por Genoma Humano Sequenciamento de Nova Geração NGS • Illumina – sequenciamento por síntese • PacBio - Single Molecule Real Time Sequencing - Pacific Biosciences • Nanopore DNA sequencing https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8 https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI https://www.youtube.com/watch?v=E9-Rm5AoZGw https://www.youtube.com/watch?v=_lD8JyAbwEo Proteômica e Metabolômica Proteômica Metabolômica O sequenciamento de proteínas é bem mais complexo!!! O que é METAGENÔMICA? Metagenoma é o nome dado ao genoma coletivo da microbiota total encontrada em um determinado habitat Específico para cada condição ambiental e biológica Meta – sentido de “além”, “transcender” O que é METAGENÔMICA? Metagenoma é o nome dado ao genoma coletivo da microbiota total encontrada em um determinado habitat. Isolamento de DNA de amostras ambientais Vetor de clonagem Fragmento de DNA Manipulação do DNA Fragmento clonado Ligação dos fragmentos com os vetores Colônias de E.coli transformadas Análise Construção de Biblioteca METAGENÔMICA Questões básicas • Quem está na amostra? • Que funções estão presentes? • Avaliação quantitativa (abundância) • Metagenômica comparativa Projetos Genoma Tradicionais Projetos em Metagenômica Escolha de um metagenoma Amostra Descrever ambiente (coleta de metadados) Avaliar diversidade Análises de rRNA 16S Fingerprinting com T-RFLP Análises baseadas em hibridização Extração DNA/RNA Criar biblioteca Novas tecnologias permitem o sequenciamento sem a construção de bibliotecas Sequenciamento Montagem Anotação Identificar genes Identificar vias metabólicas Comparar com outras comunidades Depósito e curadoria de banco de dados Bioinformática e Análise Avaliar função Expressão de genes em sistemas heterólogos Detecção de clones positivos para a função de interesse Sequenciamento de clones Quais organismos? O que eles estão fazendo? Geração de genomas completos "Diagrama" completo de um organismo Traduzido e adaptado de: RESEARCH COUNCIL (U.S.), COMMITTEE ON METAGENOMICS: CHALLENGES AND FUNCTIONAL APPLICATIONS, 2007 109 células microbianas por grama de solo 108 células microbianas por mL Mais células microbianas do que células humanas COMPLEXIDADE MICROBIANA Microbioma Humano https://www.hmpdacc.org/ Microbioma Humano https://www.hmpdacc.org/health/projectdemos.php Microbioma Humano https://www.hmpdacc.org/ihmp/overview/data-model.php https://www.nature.com/articles/d41586-019-02348-3 Consumption of Mediterranean versus Western Diet Leads to Distinct Mammary Gland Microbiome Populations Cell Reports Pub Date : 2018-10-02 , DOI: 10.1016/j.celrep.2018.08.078 Recent identification of a mammary gland-specific microbiome led to studies investigating bacteria populations in breast cancer. Malignant breast tumors have lower Lactobacillus abundance compared with benign lesions, implicating Lactobacillus as a negative regulator of breast cancer. Diet is a main determinant of gut microbial diversity. Whether diet affects breast microbiome populations is unknown. In a non-human primate model, we found that consumption of a Western or Mediterranean diet modulated mammary gland microbiota and metabolite profiles. Mediterranean diet consumption led to increased mammary gland Lactobacillus abundance compared with Western diet-fed monkeys. Moreover, mammary glands from Mediterranean diet-fed monkeys had higher levels of bile acid metabolites and increased bacterial- processed bioactive compounds. These data suggest that diet directly influences microbiome populations outside the intestinal tract in distal sites such as the mammary gland. Our study demonstrates that diet affects the mammary gland microbiome, establishing an alternative mechanistic pathway for breast cancer prevention. https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-020-00983-x https://www.nature.com/articles/s41598-017-06055-9#MOESM1 Hologenoma – genoma da planta hospedeira e da microbiota Trends in Plant Science (A) Phyllosphere Rhizosphere Soil Seeds Air (B) Epiphyte Endophyte Pathogen protection Stress tolerance (C) Epiphyte Endophyte Water and ion intake Nitrogen fixation Stress tolerance (D) Rhizosphere Root endosphere Phyllosphere Leaf endosphere Deterministic selection Stochastic processes increasing microbiota dissimilarities Assembly processes (AP) Healthy microbiota Disease-associated microbiota https://eldeveloper.github.io/cogs220/ Mapa Global de Amostras Earth Microbiome Project https://www.youtube.com/watch?v=9mUcScHdcus O grande desafio: Visão Tradicional x Holística Biologia de Sistemas! ESTUDO DIRIGIDO 1. Conceito de ômicas; 2. Construção de biblioteca genômica; 3. Construção de biblioteca cDNA; 4. Plataformas de sequenciamento NGS 5. Conceito de metagenômica.