Aula 6 - Métodos de Transformação de Plantas

LGN0232 - Genética Molecular Métodos de Transformação de Plantas 6ª aula Antonio Figueira CENA figueira@cena.usp.br • O processo de introdução de sequências (genes) de interesse em organismos chama-se transformação genética • O gene sendo transferido para o organismo é chamado de transgene • Transgene pressupõe um gene que originou-se de outra espécie! • Cisgênese – gene de espécie sexualmente compatível reintroduzido! • Organismos com modificações genéticas que recebem um transgene são denominados de transformados ou transgênicos; • Organismos Geneticamente Modificados (OGM) NÃO É TODO OGM QUE É UM TRANSGÊNICO! Conceitos Importantes OGM = Organismos Geneticamente Modificado •algodão •batata •milho •soja •milho •canola •outras Exemplos de culturas atuais Culturas resistentes à herbicida Culturas resistentes à insetos Engenharia Genética em Plantas GMO = Genetically Modified Organism Métodos de Introdução de Genes na Célula Dependente do organismo! • Seleção de tecido vegetal competente para propagação ou regeneração • Método de transferência do gene de interesse (biológico ou físico) • Identificação de células transformadas por seleção – marca de seleção • Regeneração de plantas a partir de células transformadas • Plantas transgênicas analisadas para confirmar presença do transgene - herança e estabilidade • Plantas transgênicas avaliadas para performance no campo. Etapas para a Transformação Genética de Plantas Introdução do DNA dentro da célula vegetal Regeneração da planta Seleção Construção do vetor com o transgene Avanço de gerações (sementes) Etapas Laboratório Totipotência = capacidade de regeneração da planta a partir de uma única célula Confirmação Cultura in vitro Cultura in vitro de Plantas Rotas de Morfogênese in vitro • Organogênese • Direta • Indireta – após calogênese • Embriogênese Somática • Direta • Indireta – após calogênese • Micropropagação Cultura in vitro de Plantas Micropropagação Protoplastos Micropropagação Cultura in vitro de Plantas Proliferação Desenvolvimento Germinação Planta regenerada Sementes imaturas Cultura in vitro de soja Indução Os protocolos de transformação introduzem o DNA nas células de plantas em cultura in vitro* • Cultura in vitro permite a regeneração de plantas férteis a partir de uma única célula • Grande número de células alvo na forma de calo • Estabelecimento, manutenção e regeneração de plantas é bastante trabalhoso e com um alto grau de dificuldade • Métodos estão limitados a alguns genótipos, geralmente de variedades não comerciais • Pode introduzir mutações (alterações) não desejáveis (variantes somaclonais) Transformação – Célula Alvo Célula Vegetal núcleo parede celular membrana citoplasmática transgene 1. DNA pode ser transferido para a célula vegetal por meio biológico (via Agrobacterium) ou físico (bombardeamento com micropartículas), 2. DNA deve cruzar várias barreiras 3. DNA deve se integrar ao cromossomo no núcleo da célula vegetal 4. Cada célula transformada é única 5. Número de células transformadas é mínimo. citoplasma Transferindo DNA para Células de Plantas Agrobacterium • Bactéria fitopatogênica de solo que tem a capacidade de transferir parte do seu DNA para dentro da célula da planta • No laboratório, a bactéria é colocada em cultura junto com as células de plantas, ou inoculada no tecido da planta, transferindo parte do seu DNA para as células da planta Bombardeamento (Biobalística) • Micropartículas de ouro ou tungstênio são recobertas com DNA e aceleradas em direção ao tecido da planta (hélio comprimido) • As partículas perfuram a parede celular e penetram dentro da célula • Utilizado quando não é possível por incompatibilidade biológica o uso de Agrobacterium - em monocotiledôneas. Métodos para a Introdução do Transgene na Planta Bombardeamento de microprojéteis “Biolística” ou gene gun Partículas são cobertas de DNA e aceleradas para dentro da célula da planta. Método Biológico x Físico Agrobacterium tumefaciens Propriedade natural da bactéria Agrobacterium de transferir DNA para dentro da célula da planta. • Bactéria de solo Gram-negativa, tipo bacilo • Causa ‘galha da coroa’ (crown gall disease): videira, maçã, etc. • Afeta mais dicotiledôneas e pouco monocotiledôneas • Família Rhizobiaceae • Erwin Smith – descreveu em 1892 • Outras espécies: – Agrobacterium rhizogenes -raiz em cabeleira (“hairy root”) – Agrobacterium radiobacter - não tumorogênica (sem Ti) Agrobacterium tumefaciens Galha da Coroa Patogenicidade natural de A. tumefaciens Opinas: fonte de C e N para Agrobacterium Agricultural biotechnology: Gene exchange by design (Nature 433, 583-584 2005) Patogenicidade natural de A. tumefaciens Animação Planta ferida • Libera substâncias que atraem a agrobactéria • Ativa genes da região de virulência Contato planta- bactéria • As bactérias sintetizam microfibrilas de celulose para favorecer a formação de agregados de células bacterianas em volta do tecido vegetal ferido Inserção do T-DNA • o T-DNA integrado ao genoma vegetal é expresso de forma estável • A síntese de auxinas e citocininas (oncogenes) levam a planta a um desbalanço hormonal Síntese de Opina • Quanto mais a célula da planta se divide maior é a produção de opina e o nicho da agrobactéria se torna extremamente favorável • Somente a linhagem indutora é capaz de catabolizar a opina produzida como fonte de energia, carbono e nitrogênio Apesar de sua origem procariótica, a expressão dos genes presentes no T-DNA só é possível por serem os sinais de regulação desses genes reconhecidos pelo sistema de transcrição eucarioto vegetal!! • Infecção natural – ferimentos • Quimiotactismo - fenóis, açúcares, amino ácidos • Expressão de genes da bactéria transferidos e integrados de forma estável ao genoma vegetal • Formação de tumores; • Capacidade tumorogênica - plasmídeo Ti = • Ti = Tumor Inducing - 150 a 250 kpb • Regiões do plasmídeo Ti importantes: • região T-DNA - Transfer DNA • região vir - genes de virulência Agrobacterium Plasmídeo Ti Região T-DNA • Tamanho: de 12 a 24 kb • Limitada por sequências repetidas = bordas • bordas direita (RB) e esquerda (LB) - delimitam T-DNA • Contém genes de síntese de reguladores de crescimento (hormônios vegetais) e de opinas • Transferem genes para direcionar metabolismo para manutenção da Agrobacterium Plasmídeo Ti Agrobacterium Região vir • genes responsáveis pela síntese de enzimas da transferência e integração do T-DNA Plasmídeo Ti Região vir é suficiente para transferir qualquer T-DNA - reconhece bordas Gene indutores de tumores podem ser retirados e substituídos no T-DNA Ti desarmado Agrobacterium TRANSFERÊNCIA DO TRANSGENE Característica de interesse Elementos essenciais ao processo de transferência Precisa conter no mínimo: 1. Gene de interesse – GOI = gene of interest • A região de interesse e seus elementos controladores 2. Gene Marcador de seleção • Diferenciar células/plantas transformadas e não transformadas Construção Sintética do Transgene A característica de interesse pode e deve ser engenheirada… REGIÃO CODIFICANTE Sinal poli A PROMOTOR Transgene Genes bacterianos •Resistência a antibiótico •Origem de replicação Marca de seleção na planta Construção Sintética Vetor Plasmidial Construindo o Transgene • 1 em 1.000 células terá o DNA integrado no genoma na planta • Células transformadas são marcadas pela co-introdução de um gene de resistência a agentes seletivos • Células transformadas são selecionadas pela morte de células não transformadas pelo agente seletivo • Dois tipos principais agentes seletivos: • antibióticos • herbicidas • Marcadores seletivos auxiliam os passos seguintes de estudos sobre a herança do transgene. Células em cultura (seleção) Ensaio resistência à herbicida transgênico não-transgênico Resistente Susceptível Transformação - Seleção Transformação – Seleção e Confirmação Transformação via Biobalística 1 2 3 4 5 6 Acelerador de Partículas He Transformação via Biobalística Bombardeador Disco de borracha Mola Agulha Câmara de alta pressão de hélio Membran de ruptura Suporte da membra carreadora Membrana carreadora contendo micropartículas cobertas com DNA Tela de retenção da membrana carreadora Transformação via Bombardeamento Biobalística Agrobacterium method Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid carrying desired genes Cocultivation of Agrobacterium with plant pieces DNA transferred to plant cells Cell multiplication (callus) Shoot regeneration followed by root regeneration Plant with new trait Nucleus Plant cell Chromosomes with integrated DNA encoding desired genes Particles coated with DNA encoding desired genes Particle gun Particle gun method Bombardment of plant pieces with particles GUS GFP Transformação - Confirmação Folhas de N. benthamiana https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2020.01228/full Transformação de soja via Agro-balística (A) (B) (C) (D) (E) (A) (B) (C) (A) (B) (C) (D) (E) (A) (B) (C) (D) (E) (F) Ti Plasmid Selection Marker Selection Marker RB Terminator LB Terminator Transgene Transgene Biolistic Cassette Start End Promoter Transgene Promoter Selection Marker Terminator Terminator Particles + DNA (Biolistic) DNA-Free Particles (Agrolistic) Shotgun Selection Marker Selection 1° Round Homologous Recombination RFR Plastid Vector ptDNA Plastid (Chloroplast) Selection N Rounds Electroporation PEG Nanoparticles Liposomes Ti Plasmid Transfer Proto Plast Callus Induction Cells Heteroplasmic Cell Homoplasmic Cell Transformed Plastid Untransformed Plastid Agrobacterium tumefaciens + Ti Plasmid Agrolistic Plastid Vector RFR RFR Terminator LFR LFR Terminator Transgene Leaf or Foliar Disk Embryonic Axis Callus Regeneration Rooting Acclimation Molecular/Phenotypic Characterization Basso et al. (2020) Retrocruzamento e seleção (6 - 8 gerações) Linha transgênica Cultivar comercial x x x Linhagem transgênica comercial Biotecnologia Construção da Cultivar Transgênica Via do -Caroteno em Plantas IPP Geranylgeranyl diphosphate Phytoene Lycopene  -carotene (precursor de vitamina A) Phytoene synthase Phytoene desaturase Lycopene-beta-cyclase ξ-carotene desaturase Problema: Arroz faltam estas enzimas Normal Vitamina A “Deficiente” arroz The Golden Rice IPP Geranylgeranyl diphosphate Phytoene Lycopene  -carotene (precursor de vitamina A) Phytoene synthase Phytoene desaturase Lycopene-beta-cyclase ξ-carotene desaturase Daffodil gene Um Gene de bactéria realiza as duas funções Daffodil gene Adicionar os genes da via do -Caroteno via Vitamina A está completo e funcional Golden Rice http://cdn.intechopen.com/pdfs/18820/InTech-Genetic_transformation_of_forest_trees.pdf CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) + Cas (CRISPR-associated) https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(15)01705-5.pdf CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) + Cas (CRISPR-associated) Sistema Imune Adaptativo https://www.youtube.com/watch?v=0Mkie4R7haA https://www.youtube.com/watch?v=47pkFey3CZ0 https://www.youtube.com/watch?v=MnYppmstxIs https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) + Cas (CRISPR-associated) CRISPR-Cas9 CRISPR/Cas Genome Editing and Precision Plant Breeding in Agriculture Comparação de Métodos de Melhoramento https://www.youtube.com/watch?v=UfA_jAKV29g https://www.youtube.com/watch?v=TnzcwTyr6cE https://www.youtube.com/watch?v=jAhjPd4uNFY Animações Microinjeção Por meio de agulhas microscópicas é injetado DNA no núcleo da célula alvo - rotina para transformação de célula animais - utiliza micromanipulador - complexo e demorado Transformação de Animais + - Muramatsu et al. (1997) – ELETROPORAÇÃO DNA recombinante + transgenia em embriões de frango DNA exógeno Nakamura et al., 2004 Eletroporação dos embriões – TUBO NEURAL Eletroporação in ovo Eletroporação dos embriões - SOMITOS Eletroporação in ovo Bibliografia Recomendada Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento de Plantas Ed(s) Borém, A. Fritsche-Neto, R. (2013) Cap 7 – Plantas Transgênicas, pp. 229-266. ESTUDO DIRIGIDO 1. Conceitos referentes a transgênicos 2. A importância da cultura de tecido na transformação de plantas 3. Transformação por agrobactéria 4. Transformação por biobalistica 5. Transformação animal 6. Técnica de CRISPR