Aula - Estrutura e Expressão de Genes

LGN0232 - Genética Molecular Estrutura e Expressão de Genes Antonio Figueira CENA figueira@cena.usp.br A informação genética, armazenada nos cromossomos, é transferida às células filhas através da replicação do DNA, sendo expressa através da transcrição em mRNA e traduzida subsequentemente em cadeias polipeptídicas (proteínas) DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA DNA RNA Proteína RNA PROTEÍNA REPLICAÇÃO TRANSCRIÇÃO RNA mensageiro = mRNA TRADUÇÃO DNA 5’ ATG GAG TTA TTG AAC TCT TAC AAT 3’ 3’ TAC GTC AAT AAC TTG AGA ATC TTA 5’ 5’ AUG GAG UUA UUG AAC UCU UAG AAU 3’ 3’ TAC CTC AAT AAC TTG AGA ATC TTA 5’ AUG GAG UUA UUG AAC UCU UAG AAU M E L L N N S Y Código redundante AUG GAG UUA UUG AAC UCU UAG AAU Fluxo da Informação Genética funciona do mesmo modo 3 Fluxo da Informação Genética 4 Dogma que não é Dogma! Ácidos Nucleicos DNA e RNA • DNA: Armazenamento da informação genética • Estabilidade • RNA: síntese de macromoléculas - várias funções • RNA ribossomal (rRNA) - componentes estruturais de ribossomos • RNA mensageiro (mRNA) - contém a informação genética para a sequência de aminoácidos das proteínas • RNA transferência (tRNA) - identifica e transporta os aminoácidos até o ribossomo • snRNA, snoRNA, microRNA, ncRNA Ácidos Nucleicos snRNA = small nuclear RNA - spliceossomos snoRNA = small nucleolar RNA – montagem ribossomo ncRNA = non-coding RNA – RNA regulatórios Ácidos Nucleicos São polímeros de nucleotídeos O O= P-O O Grupo fosfato N Base nitrogenada (A, G, C, or T) CH2 O C1 C4 C3 C2 5 Pentose Componentes dos Nucleotídeos Carbono-5´ Carbono-2´ Purinas: A, G Pirimidinas: U, T, C Componentes dos Nucleotídeos Ligações Fosfodiéster 5' end Cadeia de DNA crescente Livre 3'-OH DNA polimerase dTTP entrando Ponte de Hidrogênio Ligação fosfodiéster 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 5’ 3’ 3´ 5 http://www.dnaftb.org/19/animation.html Phoebus Levene Hipótese dos Tetranucleotídeos Erwin Chargaff Regra de Chargaff DNA - Ácido Desoxirribonucleico Hydrogen bond Sugar-phosphate backbone Base 1 helical turn = 3.4 nm Width = 2 nm Cytosine (C) Guanine (G) Thymine (T) Adenine (A) - Duas cadeias independentes - Dupla hélice, sentido direito - Hélices antiparalelas - Complementariedade das bases – Eixo externo hidrofílico - deoxiribose + fosfato – Bases hidrofóbicas (planas) no interior – Bases ligadas por pontes de H DNA – Fita Dupla! RNAs ocorrem no núcleo e citoplasma RNA mensageiro (mRNA): contém a informação genética para a sequência de aminoácidos das proteínas RNA transferência (tRNA): identifica e transporta os aminoácidos até o ribossomo RNA ribossômico (rRNA): constituinte dos ribossomos Principais Tipos de RNA Estrutura de RNA - RNA não possuem estrutura regular como DNA - As estruturas de RNA são complexas e únicas - Pareamento de bases similar a DNA forma estruturas tRNA rRNA (A) Tobacco plastid 16S rRNA II. Central domain III. 3’ major domain IV. 3’ minor domain I. 5’ domain (B) Tobacco plastid 23S and 4.5S rRNAs Domain II Domain III GTPase center Domain IV V13 5’ 4.5S 23S 3’ Domain V Peptidyl transferase loop Domain VI Domain I Large subunit Small subunit Possuem estrutura tridimensional específica visando promover a estabilidade e atividade catalítico nos ribossomos RNA ribossômico - rRNA Exemplos de rRNAs: - Estrutura secundária com grampos e alças Yusupova & Yusupov 2017 RNA ribossomal - rRNA • mais abundante na célula (>80%) • síntese nuclear • combinado com proteínas - ribossomo • procarioto 70S - (23S + 5S) (16S) • eucarioto 80S - (28S+5.8S+5S) (18S) Ácidos Nucleicos - RNA Eucariotos Procariotos RNA transportador - tRNA Reconhece códons em mRNA - anticódon RNA mensageiro - mRNA 1 trinca de bases nitrogenadas = 1 códon Sentido da transcrição Porque o RNA é mais lábil? Efeito de pH alcalino Porque o Timina (DNA) x Uracil (RNA)? Deaminação de Citosina a Uracil Ocorre naturalmente Afeta o significado da sequência Perda de amina em C -> U Reconhecido em DNA Citosina Uracil deaminação Pareamento em DNA C – G passaria a ser U-G Na replicação incorreria em erro Timina Três genomas em plantas: cromossomial, plastidial e mitocondrial Mitocôndria Parede celular Núcleo Citoplasma Cloroplasto Replicação de DNA Replicação de DNA Watson & Crick 1953 Meselson & Stalh 1958: replicação semiconservativa do DNA Kronenberg 1958: DNA polimerase http://www.dnaftb.org/20/animation.html Duplicação Duplicação Duplicação • A replicação do DNA é um mecanismo semiconservativo: a medida que as duas fitas complementares de uma dupla hélice parental se desenrolam e se separam, cada uma serve como um molde para a síntese de nova fita complementar • Os potenciais de ligação das bases das fitas moldes especificam as sequências de bases complementares nas fitas de DNA nascentes • A replicação é iniciada em origens únicas e em geral continua bidirecionalmente a partir de cada origem Replicação de DNA http://www.dnaftb.org/20/animation.html Replicação de Cromossomo Circular A replicação é bidirecional • A velocidade da forquilha de replicação de procarioto é cerca de 30.000 pb/min • 1 único replicon Replicação de cromossomo linear de eucarioto A velocidade da forquillha de replicação de eucarioto é cerca de 3.000 pb/min Os replicons de eucariotos têm cerca de 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes. (não conheemos todos os fatores que determinam qual origem e em que momento ela fica ativa - O timing da replicação pode, por ex. ser determinado pela atividade do gene: genes mais transcritos são replicados primeiro) 1. DNA Polimerases – Polimerização do DNA, retirada dos primers e reparo do DNA 2. Helicases – desenrolam a fita dupla 3. Topoisomerases (girases) – aliviam tensão de torsão devido a abertura da fita 4. Primases – síntese dos primers 5. Ligases - Une os fragmentos de Okasaki 6. Single strand binding (SSB) - Proteínas que se liga a fita simples de DNA 7. Telomerases – síntese das terminações Principais Enzimas Envolvidas na Replicação 5’ 3’ Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas A DNA ligase sela as quebras Mas o que é um gene? Síntese das fitas contínua e descontínua é independente Próximo ao centrômero Fim do cromossomo RNA primer Fragmento de Okazaki Sem OH para extensão covalente Telomeros e a Telomerase DNA topoisomerase II (girase) Síntese da fita líder (contínua) (DNA polimerase III) Movimento da forquilha de replicação DnaB helicase DNA primase RNA primer SSB Fita descontínua RNA primer do fragmento de Okasaki anterior Síntese da fita descontínua (DNA polimerase III) Elizabeth Blackburn Nobel 2009 Carol Greider • Gene  unidade da informação genética (hereditária) que codifica a síntese de polipeptídeo ou uma molécula de RNA estrutural • Gene inclui as regiões 5´e 3´ não codificantes, que estão envolvidas na regulação da transcrição e tradução, e todos os introns dentro do gene Wilhelm Johannsen 1909  gene mRNA  polipeptídeo tRNA e rRNA  RNA estrutural Definição de Gene Gene Típico de Procariontos Regulação da tradução Sinais para a terminação da transcrição Região codificante Regulação da transcrição 5' mRNA 3' Transcrição Códon de iniciação AUG Códon de terminação UAA Tradução Polipeptídeo Figura 14-1b Principles of Genetics, 4/e © 2006 John Wiley & Sons Regulação da tradução Regulação da transcrição Sinais para a terminação da transcrição Transcrição Tradução Códon de terminação Códon de iniciação Remoção dos introns Transcrito primário mRNA Polipeptídeo Gene Típico de Eucariotos Espécies Genoma (Mb) Genes D. melanogaster 165 ~12.000 S. cerevisiae 13 ~6.000 C. elegans 97 ~20.000 H. sapiens 3.300 ~30.000 Número de genes em Eucariotos Arquitetura de Genomas 50 kpb T. A. Brown - Genome 5 12 97 120 125 400 500 1000 2300 2700 3000 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 200000 700000 290000 670000 Tamanho do genoma (Mpb) A complexidade de um organismo não é diretamente proporcional ao tamanho do genoma Comparação do Tamanho de Genomas Paradoxo-C O que seria? Transcrição DNA ➞ RNA Do DNA ao RNA - Transcrição Controle da Expressão Gênica Alberts et al. 2010 3a ed. Transcrição - A informação genética contida num segmento do DNA é reescrita em uma fita simples de RNA - Uma fita apresenta uma sequência de ribonucleotídeos complementar a uma das fitas da dupla hélice de DNA (molde) e idêntica à sequência da outra fita (codificadora), com substituição de T por U Transcrição RNA Polimerase Animação sobre Transcrição Alberts et al. 2010 3a ed. Alberts et al. (1999) Enzima RNA Polimerase Etapa da Transcrição https://www.dnalc.org/resources/3d/central-dogma.html TATA box -10 -35 +1 mRNA Início da transcrição Reconhecimento da RNA polimerase downstream = a jusante upstream = a montante região codificante região regulatória Região Promotora de Gene Procarioto TATA box -25 -75 +1 mRNA Início da transcrição Reconhecimento da RNA polimerase downstream = a jusante upstream = a montante região codificante região regulatória CCAAT box Região Promotora de Gene Eucarioto 1. Os precursores são ribonucleotídeos 2. Apenas 1 fita de DNA é utilizada como molde para a síntese de RNA complementar 3. As cadeias de RNA são sintetizadas sem a necessidade de um filamento primer preexistente (atuação da RNA polimerase) 4. Síntese é complementar ao DNA, mas A  U 5. Polimerização sentido 5’  3’ 6. RNA polimerase inicia a transcrição em sequências específicas de nucleotídeos  promotores (regiões regulatórias) 7. RNA polimerase termina a transcrição em sequências específicas de nucleotídeos  terminadores (finalizadores) Características Gerais da Síntese de RNA  o término das cadeias de RNA ocorre quanto a RNA polimerase encontra um sinal de término, e quando isso ocorre o complexo é liberado Término da Transcrição Gene de Procarionto Regulação da tradução Sinais para a terminação da transcrição Região codificante Regulação da transcrição 5' mRNA 3' Transcrição Códon de iniciação AUG Códon de terminação UAA Tradução Polipeptídeo Figura 14-1b Principles of Genetics, 4/e © 2006 John Wiley & Sons Transcrição simultânea múltipla - Procariotos Direção de transcritos em Procariotos Alberts et al. 2010 3a ed. Regulação da tradução Regulação da transcrição Sinais para a terminação da transcrição Transcrição Tradução Códon de terminação Códon de iniciação Remoção dos introns Transcrito primário mRNA Polipeptídeo Gene de Eucarioto Gene de Eucarioto Capeamento e poliadronelação do RNA Sequência codificadora Sequência não codificadora AAAAAA150-250 Cauda poli-A RNA Proteína Quepe 5' Ligação de trifosfato 5'-5' Extremidade 5' do transcrito de RNA inicial 7-metilguanosina Splicing Alternativo gerando diversas Proteínas Eucariotos Splicing alternativo do gene de α-tropomiosina de rato Estrutura de genes humanos com arranjos de exons e introns Alberts et al. 2010 3a ed. Isoformas de Proteínas Gene Promotor Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Intron 1 Intron 2 Intron 3 Intron 4 Terminador Transcrito primário STEP 1 Transcrição STEP 2 Processamento alternativo Família de mRNA STEP 3 Tradução Isoformas de polipeptídeos Etapas características da transcrição Eucariotos Procariotos Animação Splicing Alberts et al. 2010 3a ed. Tradução RNA ➞ Proteína  Todos os RNAs mensageiros são lidos na direção 5’- 3’  As cadeias polipeptídicas são sintetizadas da extremidade amino (NH3) para o terminal carboxílico (COOH) – ligação peptídica  A tradução é realizada nos ribossomos, com os RNA transportadores como adaptadores entre o molde de mRNA e os aminoácidos Cada aminoácido é especificado por três bases (códon) no mRNA – código genético universal Características Gerais da Tradução Estrutura da Proteína Aminoácidos (20 tipos):  grupo amino  grupo carboxila  grupo lateral Grupo amino Grupo carboxila Grupo Lateral (R) 1. Grupos laterais hidrofóbicos ou não polares glicina (Gly) [G] alanina (Ala) [A] valina (Val) [V] leucina (Leu) [L] isoleucina (Ile) [I] prolina (Pro) [P] fenilalanina (Phe) [F] triptofano (Trp) [W] metionina (Met) [M] 2. Grupos laterais hidrofilicos ou polares serina (Ser) [S] treonina (Thr) [T] tirosina (Tyr) [Y] asparagina (Asn) [N] glutamina (Gln) [Q] cisteína (Cys) [C] 3. Grupos laterais ácidos Ácido aspártico (Asp) [D] Ácido glutâmico (Glu) [E] 4. Grupos laterais básicos lisina (Lys) [K] arginina (Arg) [R] histidina (His) [H] Ligação Peptídica Proteína - direção de síntese Codon e Anticodon mRNA ANTICODON AMINO ACID #5 A leitura correta do código genético pelo ribossomo é vital!!! Frameshift! QUADRO DE LEITURA Terminação: três códons terminam a síntese protéica – UAG – UAA – UGA - Início: códon de iniciação da síntese protéica – AUG - METIONINA Start codon e Stop codon AUG AAUAAA AAA Região codificante do gene 5’ UTR 3’ UTR  Delimitam a região codificante (região que é transcrita e traduzida!) mRNA 70 Start codon e Stop codon TTCATACTTGGTTAAGACCTTTACAAGCCGACCAACGTGGTGAC AGTGTCGTCCTTTACGCACCGAATCCCTTTATCATTGAATTAGT AGAAGAGCGATACTTAGGACGTCTTCGGATGGAATCTTGGTCCC GTTGCCTGGAACGTCTTGAAACTGAATTCCCGCCAGAAGATGTT CATACTTGGTTAAGACCTTTACAAGCCGACCAACGTGGTGACAG TGTCGTCCTTTACGCACCGAATCCCTTTATCATATTGAATTAGT AGAAGAGCGATACTTAGGACGTCTTCGGGAATTGTTATCCTATT TCTCAGGAATACGTGAAGTAGTCCTTGCAATTGGCTCACGACCT AAAACAACAGAACTACCCGTACCAGTAGACACTACAGGACGTTT GTCTTCAACAGTCCCATTTAACGGAAATCTCGACACACACTATA ACTTTGATAATTTTGTTGAGGGACGAAGCAATCAACTCGCTCGT GCTGCAGCTTGGCAAGCGGCACAGAAACCGGGAGACCGTACTCA CAACCCTCTATTGCTCTATGGTGGGACTGGTTTGGGTAAAACCC ATTTAATGTTTGCTGCAGGTAACGTAATGCGGCAAGTAAACCCA ACTTATAAAGTAATGTATCTTCGTTCGGAACAGTTTTTCAGCGC CATGATAAGAGCGTACAAGATAAAAGTATGGATCATAAGGGTAA Tradução: Início e Fim 5´ - GCC (A ou G) CC AUGG - 3` (Sequência de Kozak) PROCARIOTO EUCARIOTO Sinais para o início da Tradução Sinal para o início da tradução em eucariotos mRNA Regiões UTR = regiões não-traduzidas (UnTranslated Region) Regiões anteriores e posteriores a codificadora 5´ UTR 3´UTR E - sítio de saída do tRNA P - sítio de ligação peptidil A - sítio de ligação aminoacil Tradução tRNA iniciador Ligação com o mRNA Movimento até encontrar a o códon AUG Fatores de iniciação dissociam-se da subunidade menor do ribossomo Subunidade maior do ribossomo se liga à menor Aminoacil-tRNA se liga ao sítio A Figure 7-35 part 4 of 5 Essential Cell Biology 3/e © Garland Science 2010 Primeira ligação peptídica entre os aa E continuadamente…. https://www.dnalc.org/resources/3d/16-translation-advanced.html Chaperonas e Tradução Dobramento de proteínas Proteínas de Choque Térmico (HSPs) BiP (Binding Protein): HSP70 do RE Chaperonas e Transporte de Proteínas Cadeia peptídica Chaperona citosólico Chaperona mitocondrial Proteína dobrada Mitocôndria Visão Geral Animação: http://www.youtube.com/watch?v=983lhh20rGY&feature=related Leitura Recomendada Capítulos: 5, 6 e 7 – Estará no no Stoa! Estudo Dirigido 1. Diferenças fundamentais entre DNA e RNA; 2. Estrutura e função do DNA; 3. Principais características da dupla hélice do DNA; 4. Principais tipos e funções dos RNAs; 5. Definição de gene; 6. Diferença na estrutura dos genes de eucariotos e procariotos; 7. Região promotora e sua importância para a transcrição em eucariotos e procariotos; 8. Região codificante: start codon e stop codon. 9. Processo de tradução Dogma Central da Biologia Celular - Mapa conceitual