Slide - Estudos das Ômicas - 2023-2

LGN0232 - Genética Molecular Estudos das “Ômicas”: Genômica, Transcritômica e Metagenômica Antonio Figueira CENA figueira@cena.usp.br Dogma Central da Biologia Molecular Genoma Transcriptoma Proteoma O que seria Ômica? O que seria Ômica? Todos os constituintes considerados coletivamente! Gene – Genoma (Genomic) Transcrito – Transcritoma (Transcriptomic) Proteína – Proteoma (Proteomic) Metabólitos – Metaboloma ... Estonian Biocentre O que seriam Ômicas? E há mais: epigenoma, lipidoma, interatoma, fluxoma, ionômica etc… Name Target Genomics Genomics Genes (DNA sequence) Epigenomics Modification of DNA and DNA-binding proteins Transcriptomics1 Transcriptomics mRNA ncRNAomics non-coding RNA (including microRNA) Proteomics Proteomics Proteins Phosphoproteomics Protein phosphorylation Localizomics2 Protein localization Fluxomics2 Protein flux Interactomics2 Protein-protein interaction Structural Protein structure Proteomics Metabolomics Metabolomics Metabolites Lipidomics Lipids Aminomics Amino acids Others Glycomics Sugar chains Cytomics Cells Populomics Human population Exposomics Environmental exposure3 Four major categories and their subcategories are shown. 1 Transcriptomics can be regarded as a subcategory of genomics. 2 Corresponding omics of metabolites can also be the targets. In addition, omics analysis of protein-metabolite interaction may be possible. 3 Borrell, 2011 Avanços tecnológicos recentes permitiram o surgimento da Era das Ômicas FENÓTIPO Ambiente Avanços tecnológicos recentes permitiram o surgimento da Era das Ômicas FENÓTIPO Ambiente Em um organismo, somente o genoma permanece constante, independente do estágio de desenvolvimento, tecido e ou condição ambiental! conjunto de todas as características observáveis – que são influenciadas tanto por seu genótipo quanto pelo ambiente Diferentes estímulos podem afetar diretamente o transcritoma, o proteoma e o metaboloma,.... Genoma: toda a informação hereditária de um organismo que está codificada em seu DNA (ou, em alguns vírus no RNA). Isto inclui tanto os genes como as sequências não-codificadoras e regiões regulatórias. Transcritoma: conjunto completo de transcritos (RNAs mensageiros, RNAs ribossômicos, RNAs transportadores e os microRNAs) de um dado organismo, órgão, tecido ou linhagem celular. Portanto, é o reflexo direto da expressão dos genes. Proteoma: conjunto de todas as proteínas em uma célula, organela fluido biológico, tecido ou organismo em um dada condição biológica Metaboloma: conjunto de todos os metabólitos em uma célula, fluido biológico, tecido ou organismo em dada condição biológica Definindo Conceitos constituintes coletivamente Primários Secundários DNA e RNA 1- O que são? 2- Qual a estrutura? São ácidos nucleicos, encontrados em todas as células. Estão envolvidos na transmissão de caracteres hereditários e na produção de proteínas Proteínas 1- O que são? 2- Qual a estrutura? São moléculas orgânicas de estrutura complexa e Massa Molecular elevada. São sintetizads pelos organismos vivos através de ligações peptídicas covalentes entre aminoácidos. Funções: enzimas, anticorpos, componentes estruturais,... Metabólitos 1- O que são? 2- Qual a estrutura? Metabólitos são os intermediários (substratos, cofatores) e produtos do metabolismo! Ciclo de Calvin Carboidratos Álcoois Aminoácidos Ácidos orgânicos Lipídios 4 Bases 20 Amino ácidos 2x105 metabólitos Metabolômica Proteômica Genômica/ transcritômica Diversidade Química A pirâmide da vida Dificuldades do estudos de Ômicas Vamos estudar somente como obter informação das 4 bases! Como estudar o Genoma e o Transcritoma? Abordagem Histórica e a Atual Sequenciamento de DNA e RNA Biblioteca Genômica: coleção de clones de DNA representando o genoma de um organismo Biblioteca de cDNA: coleção de clones com insertos de DNA complementar (cDNA), sintetizados a partir de moléculas de mRNA de uma amostra (condição biológica) Método clássico – sequenciamento Sanger: • Método Maxam & Gilbert (1977)* - Método de degradação química • Método Sanger (1977) - Método enzimático, dideoxi ou de término da cadeia - Síntese enzimática de uma fita complementar de DNA, cujo crescimento é interrompido pela adição de um dideoxinucleotídeo (ddNTP) - Usava marcação radioativa, posteriormente fluorescente *Produtos tóxicos e perigosos à saúde, além da dificuldade de automatização, essencial para o sequenciamento de um genoma completo. Prêmio Nobel em Química (1980) Tecnologias para o sequenciamento de DNA Tecnologias de 1ª geração: Frederick Sanger Sequenciamento por Maxam-Gilbert Maxam-Gilbert sequencing 5’ *pGpApTpCpGpGpApCpC 3’ G rxn G + A rxn T + C rxn C rxn G G + A T + C C 3’ *GATCGGACC *GATCGGAC *GATCGGA *GATCGG *GATCG *GATC *GAT *GA *G 5’ 32PGCTACGTA 3’ Cleavage at: A+G G C C+T 32PGCT 32PGCTAC 32PGCTA 32PGC 32PG 32PGCTA 32PGCTAG Sequence Gel A+G G C C+T 7 6 5 4 3 2 1 Sequencing Gel A T G C A T C Sequenciamento por Sanger Sequenciamento Sanger ssDNA ddATP ddTTP ddCTP ddGTP electrophoresis reading sequencing gel (slab or capillary gel) A T G C C A G G A C G C T G A T deduced DNA sequence animação animação Corante Fluorescente Nucleotídeos dNTPs Nucleotídeos ddNTPs (Terminadores) Falta 3’-OH ddCTP ddATP ddGTP ddTTP G A T T C A G C dye-labeled dideoxynucleotides are used to generate DNA fragments of different lengths 120 130 GAT AAAT CT GG TCTT ATT TCC Bibliotecas Genômicas DNA de interesse Clivar com enzima de restrição/ou mecanicamente Fragmentos de DNA Fragmentos inseridos em Plasmídeos usando Ligase Moléculas de DNA recombinante Introdução dos Plasmídeos nas Bactérias Biblioteca genômica Construção de Bibliotecas Genômicas Esquema básico para construção de uma biblioteca genômica Biblioteca Genômica de DNA DNA genômico Extração de DNA vetores plasmidiais disgestão com enzimas de restrição célula DNA fragmentado Vetores clivados ligaçào com DNA ligase inserção em bactérias DNA Coleção de DNA genômico (Biblioteca) Biblioteca Genômica de DNA DNA genômico Extração de DNA vetores plasmidiais disgestão com enzimas de restrição célula DNA fragmentado Vetores clivados ligaçào com DNA ligase inserção em bactérias DNA Coleção de DNA genômico (Biblioteca) 1. Extração de DNA 2. Fragmentação do DNA 3. Ligação em vetores 4. Inserção em bactérias 5. Multiplicação (clones) Etapas: Construção de Bibliotecas Genômicas 1 plasmídeo 1 célula Transformação Plasmídeo recombinante Enzima de restrição Enzima de restrição DNA cromossômico Gene alvo DNA Recombinante Transformação Célula hospedeira Juang RH (2004) BCbasics Plasmídeo Construção de Bibliotecas Genômicas Fragmentos de DNA sequenciados Fragmentos Completos Biblioteca de insertos pequenos Montagem dos fragmentos Fechamento dos gaps Análise Bibliotecas de cDNA Construção de Bibliotecas de cDNA cDNA : DNA sintetizado a partir do mRNA usando a enzima transcriptase reversa. mRNA DNA Vetor E. coli *cDNA: DNA complementar ao mRNA mRNA Cauda poli (A) Primer oligo (dT) Síntese da primeira fita de DNA pela transcriptase reversa Ribonuclease H degrada o RNA Síntese da segunda fita de DNA pela DNA polimerase I Finalização da síntese da segunda fita de DNA RNA DNA SÍNTESE DE cDNA Esquema básico para construção de uma biblioteca de cDNA CRIANDO UMA BIBLIOTECA DE cDNA 1. Isolamento de mRNAs das células 2. Uso da transcriptase reversa para sintetizar a fita complementas ao mRNA. Uso da DNA polimerase para sintetizar a dupla fita (cDNA). 3. Inserção do cDNA em vetores e introdução em células. Biblioteca de cDNA Coleção de cDNAs em bibliotecas, representadas por DNA provindo de cada gene expresso CRIANDO UMA BIBLIOTECA DE cDNA 1. Isolamento de mRNAs das células 2. Uso da transcriptase reversa para sintetizar a fita complementas ao mRNA. Uso da DNA polimerase para sintetizar a dupla fita (cDNA). 3. Inserção do cDNA em vetores e introdução em células. Biblioteca de cDNA Coleção de cDNAs em bibliotecas, representadas por DNA provindo de cada gene expresso Vantagem: somente os genes expressos são selecionados (clonados)! 1. Extração de mRNA 2. Síntese de cDNA 3. Ligação em vetores 4. Inserção em bactérias 5. Multiplicação (clones) Etapas: Construção de Bibliotecas de cDNA Sequenciamento de ‘Nova Geração’ NGS Tecnologia de primeira geração Tecnologias de segunda geração Custo de Sequenciamento https://www.genome.gov/sequencingcostsdata Custo de Sequenciamento por Megabases de DNA Lei de Moore: dobrar a capacidade de processamento https://www.genome.gov/sequencingcostsdata Custo de Sequenciamento por Genoma Humano Sequenciamento de Nova Geração NGS • Illumina – sequenciamento por síntese https://www.youtube.com/watch?v=WKAUtJQ69n8 • PacBio - Single Molecule Real Time Sequencing - Pacific Biosciences • Nanopore DNA sequencing https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8 https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI https://www.youtube.com/watch?v=E9-Rm5AoZGw https://www.youtube.com/watch?v=_lD8JyAbwEo https://www.youtube.com/watch?v=7YcHIh_Nz5I Comparação de vantagens das tecnologias https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-13-341/tables/1 Porque ainda se usa Sanger? Proteômica e Metabolômica Proteômica Metabolômica Separação de proteínas Por tamanho – SDS-PAGE Por pontos isoelétrico e tamanho 2D – SDS-PAGE O sequenciamento de proteínas é mais complexo!!! Fluxograma de Metabolômica O que seria Metagenômica? O que é METAGENÔMICA? Metagenoma é o nome dado ao genoma coletivo da microbiota total encontrada em um determinado habitat Específico para cada condição ambiental e biológica Meta – sentido de “além”, “transcender” Isolamento de DNA de amostras ambientais Vetor de clonagem Fragmento de DNA Manipulação do DNA Fragmento clonado Ligação dos fragmentos com os vetores Colônias de E.coli transformadas Análise Construção de Biblioteca METAGENÔMICA Questões básicas • Quem está na amostra? • Que funções estão presentes? • Avaliação quantitativa (abundância) • Metagenômica comparativa Escolha de um metagenoma Projetos Genoma Tradicionais Projetos em Metagenômica Amostra Avaliar diversidade Descrer ambiente (coleta de metadados) Extração DNA/RNA Análises de rRNA 16S Fingerprinting com T-RFLP Análises baseadas em hibridização Criar biblioteca Novas tecnologias permitem o sequenciamento sem a construção de bibliotecas Sequenciamento Montagem Anotação Depósito e curadoria de banco de dados Avaliar função Expressão de genes em sistemas heterólogos Detecção de clones positivos para a função de interesse Sequenciamento de clones Bioinformática e Análise Identificar genes Identificar vias metabólicas Geração de genomas completos Comparar com outras comunidades "Diagrama" completo de um organismo QUAIS ORGANISMOS? O QUE ELES ESTÃO FAZENDO? Traduzido e adaptado de: RESEARCH COUNCIL (U.S.), COMMITTEE ON METAGENOMICS: CHALLENGES AND FUNCTIONAL APPLICATIONS, 2007 109 células microbianas por grama de solo 108 células microbianas por mL Mais células microbianas do que células humanas COMPLEXIDADE MICROBIANA Microbioma - Aplicações Linking Long-Term Dietary Patterns with Gut Microbial Enterotypes Gary D. Wu,1 Jun Chen,2,3 Christian Hoffmann,4,5 Kyle Bittinger,4 Ying-Yu Chen,1 Sue A. Keilbaugh,1 Meenakshi Bewtra,1,2 Dan Knights,6 William A. Walters,7 Rob Knight,8,9 Rohini Sinha,4 Erin Gilroy,2 Kernika Gupta,10 Robert Baldassano,10 Lisa Nessel,2 Hongzhe Li,2,3 Frederic D. Bushman,4* James D. Lewis1,2,3* www.sciencemag.org SCIENCE VOL 334 7 OCTOBER 2011 ORIGINAL ARTICLE Saliva microbiomes distinguish caries-active from healthy human populations Fang Yang1, Xiaowei Zeng2, Kang Ning2, Kuan-Liang Liu3, Chien-Chi Lo3, Wei Wang2, Jie Chen2, Dongmei Wang3, Ranran Huang3, Xingzhi Chang3, Patrick S Chain3, Gary Xie3, Junqi Ling1 and Jian Xu2 1Department of Operative Dentistry and Endodontics, Guanghua School and Hospital of Stomatology and Institute of Stomatological Research, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong, China; 2Chinese Academy of Sciences, Qingdao Institute of Oceanology and Biogeosciences and Bioprocess Technology, Qingdao, Shandong, China and 3Oralgen, B-6, Bioscience Division, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, USA The ISME Journal (2012) 6, 1–10 © 2012 International Society for Microbial Ecology All rights reserved 1751-7362/12 www.nature.com/ismej Microbioma Humano https://www.hmpdacc.org/ Microbioma Human microbiome 1,000,000+ genes Human genome 23,000 genes Microbioma Humano HMP1 Nasal Oral Vagina Gut Skin Healthy cohort study Demonstration projects Community composition Microbial pathways Host genome sequences Microbial isolate genomes Characterize microbiomes Correlate with phenotype HMP2 Preterm birth Inflammatory bowel diseases Pre-diabetes Longitudinal sampling Community composition Microbial pathways Virome profiles Antibody profiles Host genomes Epigenome profiles Cytokine profiles (Meta)transcriptomics (Meta)proteomics Metabolomics Characterize the host and microbiome Follow dynamics over time HMP DCC Data, tools, protocols Microbioma Humano https://www.hmpdacc.org/ihmp/overview/data-model.php https://www.nature.com/articles/d41586-019-02348-3 Consumption of Mediterranean versus Western Diet Leads to Distinct Mammary Gland Microbiome Populations Cell Reports Pub Date : 2018-10-02 , DOI: 10.1016/j.celrep.2018.08.078 Recent identification of a mammary gland-specific microbiome led to studies investigating bacteria populations in breast cancer. Malignant breast tumors have lower Lactobacillus abundance compared with benign lesions, implicating Lactobacillus as a negative regulator of breast cancer. Diet is a main determinant of gut microbial diversity. Whether diet affects breast microbiome populations is unknown. In a non-human primate model, we found that consumption of a Western or Mediterranean diet modulated mammary gland microbiota and metabolite profiles. Mediterranean diet consumption led to increased mammary gland Lactobacillus abundance compared with Western diet-fed monkeys. Moreover, mammary glands from Mediterranean diet-fed monkeys had higher levels of bile acid metabolites and increased bacterial- processed bioactive compounds. These data suggest that diet directly influences microbiome populations outside the intestinal tract in distal sites such as the mammary gland. Our study demonstrates that diet affects the mammary gland microbiome, establishing an alternative mechanistic pathway for breast cancer prevention. https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-020-00983-x https://www.nature.com/articles/s41598-017-06055-9#MOESM1 1 = bottom 2 = top A B C Phylum Actinobacteria Bacteroidetes Chloroflexi Firmicutes Planctomycetes Proteobacteria Saccharibacteria Verrucomicrobia WPS-2 Class Actinobacteria Alphaproteobacteria Bacilli Bacteroidia Betaproteobacteria Clostridia Deltaproteobacteria Gammaproteobacteria Phycisphaerae Planctomycetacia Saccharibacteria_TM7-3 Sphingobacteria Thermomicrobia Verrucomicrobiae WPS-2_other Order Actinomycetales Aeromonadales Alteromonadales Bacteroidales Bdellovibrionales Burkholderiales Caulobacterales Clostridiales Enterobacteriales Flavobacteriales Gammaproteobacteria_other Lactobacillales Moraxellaceae Pseudomonadales Rhizobiales Rhodobacterales Rhodospirillales Sphingomonadales Vibrionales WPS-2_other_other Xanthomonadales Family Bacteroidaceae Bdellovibrionaceae Bevibacteriaceae Caulobacteraceae Comamonadaceae Enterobacteriaceae Flavobacteriaceae Gordoniaceae Microbacteriaceae Moraxellaceae Pseudomonadaceae Rhizobiaceae Rhodobacteraceae Rhodospirillaceae Sphingomonadaceae Sphingomonadales WPS-2_other_other_other Xanthomonadaceae All Other Categories video Proteobacteria Gammaproteobacteria Pseudomonadales Actinomycetales Alphaproteobacteria Risk group 2 bacteria OTU 20385 OTU 00341 Pseudomonas_sp. OTU 21318 OTU 13501 OTU 00927 OTU 06378 Hologenoma – genoma da planta hospedeira e da microbiota artigo https://eldeveloper.github.io/cogs220/ Mapa Global de Amostras Earth Microbiome Project https://www.youtube.com/watch?v=9mUcScHdcus O grande desafio: Visão Tradicional x Holística Biologia de Sistemas! ESTUDO DIRIGIDO 1. Conceito de ômicas; 2. Construção de biblioteca genômica; 3. Construção de biblioteca cDNA; 4. Plataformas de sequenciamento NGS 5. Conceito de metagenômica.