Doenças Virais de Importância Clínica em Virologia

125 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Unidade III 7 VIROLOGIA CLÍNICA 71 Principais doenças virais de importância clínica Para se compreender melhor algumas doenças de etiologia viral é importante entender que muitas infecções virais são subclínicas ou seja não apresentam sintomas São o que chamamos assintomáticas e portanto difíceis de serem percebidas eou diagnosticadas O mesmo vírus pode provocar uma grande variedade de doenças o que significa que muitos vírus diferentes são capazes de causar o mesmo quadro clínico e o mesmo quadro clínico pode ser causado por vírus diferentes dificultando o diagnóstico e influenciando a implementação de técnicas e procedimentos laboratoriais que visem a uma melhor elucidação dos casos A doença produzida não tem relação com a morfologia viral e a evolução de qualquer caso é determinada pela constituição genética do vírus e do hospedeiro As doenças de etiologia viral para serem mais bem compreendidas podem ser divididas em generalizadas nas quais os vírus se propagam pelo organismo por meio da corrente sanguínea com comprometimento sistêmico exemplo sarampo rubéola varicela febre amarela dengue e enterovírus ou doenças órgãosespecíficas como as que acometem o SNC tais como a poliomielite meningite Poliovirus Coxsackie e Echovirus raiva encefalite rabdovírus sarampo caxumba herpes etc o trato respiratório como as pneumonias bronquites bronquiolites gripes e resfriados influenza parainfluenza vírus sincicial respiratório VRS pele e mucosas como nas infecções por herpes simples tipo 1 oral herpes simples tipo 2 genital herpes zoster sarampo e varicela hepáticas por vírus da hepatite tipo A infecciosa hepatite B sérica tipo C e E as que acometem as glândulas salivares como na caxumba e infecção por citomegalovirus o trato gastrintestinal típicas da infecção por Rotavirus e adenovírus entérico e por fim as sexualmente transmissíveis como as causadas pelos vírus da herpes simples hepatite B papilomavírus Retrovirus A seguir apresentase uma breve explanação acerca de alguns vírus de importância epidemiológica no Brasil e no mundo Poliomielite Poliovirus Os Poliovirus multiplicamse inicialmente nas mucosas especificamente nas placas de Peyer e nas tonsilas em que a replicação pode ser detectada em até 3 dias Os vírus multiplicamse nos linfonodos acarretando em uma pequena viremia invadindo o sistema retículoendotelial É nesse momento que o sistema nervoso central pode ser invadido A maioria dos indivíduos infectados com poliovírus controla a infecção antes da viremia secundária o que resulta em infecção assintomática Alguns estudos sugerem que a disseminação para o sistema nervoso central pode ocorrer pelos nervos periféricos ou craniais por fluxo axonal retrógrado A infecção pelo Poliovirus no SNC pode acarretar em paralisia flácida 126 Unidade III permanente dos membros inferiores e portanto reiterase a necessidade de se manterem altos níveis de vacinação em razão de o vírus ainda não ter sido considerado erradicado em termos mundiais Gripes e resfriados Embora se faça confusão entre a gripe ou influenza e o resfriado comum essas doenças são causadas por tipos diferentes de vírus Os vírus da gripe quase sempre provocam febre prostração cefaleia dores musculares tosse seca espirros e obstrução nasal O resfriado comum é uma doença mais branda causada por diversos vírus que atacam apenas as partes altas do aparelho respiratório nariz e faringe A mucosa nasal inflamada elimina grande quantidade de líquido claro e aquoso coriza Geralmente ocorrem também espirros cefaleia secura na garganta e mais raramente um ligeiro aumento da temperatura do corpo Ambas as doenças são transmitidas por gotículas de secreção das vias respiratórias lançadas no ambiente por meio da tosse ou do espirro A disseminação é facilitada pelas aglomerações humanas pela poeira pelo frio que irritam a mucosa das vias aéreas e pelas más condições de higiene e alimentação a doença é autolimitante durando de 3 a 7 dias A imunidade natural ou por vacinação não é duradoura pois novas formas de vírus mutantes contra as quais o organismo humano ainda não produziu anticorpos aparecem rapidamente Os antibióticos não exercem nenhum efeito e devem ser restringidos a não ser nos casos de infecções bacterianas secundárias Recomendase apenas repouso hidratação e tratamento sintomático com analgésicos antitérmicos e descongestionantes nasais Influenza pandêmica AH1N1 virus Muitas epidemias foram originadas pelo Influenza A virus A linhagem H1N1 circulou entre humanos em 1918 e foi o agente etiológico da pandemia conhecida como gripe espanhola Esse vírus resultou na morte de 20 a 50 milhões de indivíduos em todo o mundo O novo subtipo do influenza A virus H1N1 virus é resultante de uma recombinação genética do vírus suíno humano e aviário Em 2009 foi detectado no México colocando em alerta a saúde pública mundial pois essa nova cepa rapidamente se disseminou causando uma pandemia No Brasil até o final do ano de 2009 foram detectados aproximadamente 40 mil casos graves e 1705 óbitos registrados Sua transmissão ocorre diretamente de pessoa para pessoa por meio de gotículas de saliva que são expelidas pelo indivíduo infectado ao falar tossir e espirrar O contágio pode ocorrer ainda de maneira indireta por meio de contato com secreções do indivíduo doente Nesse caso as mãos são o principal veículo ao propiciarem a introdução de partículas virais diretamente nas mucosas oral nasal e ocular Clinicamente a doença iniciase com a instalação abrupta de febre alta perdura por três dias em geral acima de 38 C seguida de mialgia dor de garganta prostração cefaleia e tosse seca É comum a queixa de garganta seca rouquidão e queimação retroesternal ao tossir bem como pele quente e 127 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA úmida olhos hiperemiados e lacrimejantes Há hiperemia das mucosas com aumento de secreção nasal hialina O quadro clínico em adultos sadios pode variar de intensidade Nas crianças a temperatura pode atingir níveis mais altos sendo comum o aumento dos linfonodos cervicais Quadros de bronquite ou bronquiolite além de sintomas gastrointestinais também podem fazer parte da apresentação clínica em crianças Os idosos quase sempre se apresentam febris às vezes sem outros sintomas mas em geral a temperatura não atinge níveis tão altos Coronavírus Os coronavírus pertencem à subfamília Coronavirinae família Coronaviridae São grandes vírus com uma única fita de RNA e um nucleocapsídeo estrutura composta pelo ácido nucleico do vírus nesse caso RNA e seu invólucro proteico o capsídeo helicoidal Seu nome se deve a espículas estruturas proeminentes presentes na superfície do vírus o que lhe dá a aparência de uma coroa solar corona em latim Os coronavírus são responsáveis por desencadearem infecções respiratórias Entre os problemas mais conhecidos estão o resfriado comum a síndrome respiratória aguda grave também chamada Sars e a síndrome respiratória do Oriente Médio também chamada Mers Além disso no final do ano de 2019 um novo tipo de coronavírus foi descoberto na China sendo responsável por uma série de mortes A seguir são descritas algumas das principais características das doenças causadas por esse vírus Resfriado comum afeta as vias aéreas superiores e pode ser causado por diferentes vírus incluindo o coronavírus Geralmente leva a sintomas como obstrução nasal coriza espirro e tosse Normalmente as pessoas com resfriado não apresentam febre ou apresentam apenas febre baixa Síndrome respiratória aguda grave Sars é muito grave e foi identificada pela primeira vez na China em 2002 A infecção teve início após contato com gatos selvagens doentes Essa doença evoluía de maneira muito rápida para insuficiência respiratória e foi responsável por causar a morte de cerca de 800 pessoas A epidemia foi interrompida em 2003 e desde 2004 nenhum caso da doença foi registrado Síndrome respiratória do oriente médio Mers foi identificada pela primeira vez no ano de 2012 na Arábia Saudita A transmissão iniciouse após dromedários serem infectados os quais são importantes reservatórios dos vírus Até 22 de maio de 2014 204 mortes já haviam sido confirmadas em decorrência doença Coronavírus SarsCoV2 foi isolado no dia 7 de janeiro de 2020 e descoberto após uma série de infecções respiratórias sem explicação iniciarse na China Até o dia 27 de janeiro de 2020 80 mortes já haviam sido confirmadas em decorrência da doença A principal suspeita é que a infecção pelo novo coronavírus tenha sido iniciada pelo consumo de carne de animais como cobras e morcegos 128 Unidade III Saiba mais Em janeiro de 2020 foi identificada na China uma nova cepa de coronavírus formalmente designada coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave SarsCoV2 causadora da doença denominada pela Organização Mundial de Saúde OMS como covid19 Tornouse portanto urgente compreender e implementar as práticas recomendadas para o diagnóstico laboratorial do SarsCoV2 em todo Brasil e isso inclui entre outras palavras conhecer aspectos relacionados com a coleta de amostras a biossegurança no transporte e no manuseio de amostras clínicas que possam conter o SarsCoV2 bem como os testes recomendados em cada situação ou caso suspeito Leia PINHO J et al Diagnóstico laboratorial da infecção pelo novo coronavírus covid19 posicionamento oficial da sociedade brasileira de patologia clínicamedicina laboratorial SBPCML Sociedade Brasileira de Patologia Clínica sd Disponível em httpsbitly3w53kwU Acesso em 1º jul 2021 Varicela catapora vírus da varicelazoster HHV3 O agente etiológico da varicela catapora e do herpeszoster é o Human herpesvirus 3 Na catapora as células da pele tornamse os principais sítios para a replicação viral Surgem as lesões de característica maculopapular as quais evoluem para vesículas e depois para ulcerações e necrose da derme Os sintomas de febre malestar cefaleia e dor abdominal frequentemente ocorrem por 24 a 48 horas antes do aparecimento do exantema Sintomas como febre irritabilidade letargia e perda de apetite são comuns e tendem a desaparecer nas primeiras 72 horas após aparecimento do exantema O exantema se inicia na face ou tronco e gera um prurido intenso Após 24 a 48 horas o fluido vesicular tornase turvo e as crostas aparecem Lesões da orofaringe conjuntiva e vagina são comuns Lesões novas aparecem por até 6 dias e a varicela subclínica é muito rara A reativação apresentase tipicamente como herpeszoster um exantema vesicular em geral confinado à distribuição de um ou mais nervos sensoriais Em indivíduos imunocomprometidos o exantema é em geral mais extenso e a replicação cutânea é acompanhada por viremia Novas lesões aparecem por até 7 dias Doença exantemática rubéola vírus da rubéola O vírus é transmitido principalmente por partículas geradas por pessoas infectadas podendo ser detectado em secreções nasofaríngeas de 7 a 14 dias após o aparecimento do exantema 129 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA O início da infecção se dá em células epiteliais do trato respiratório superior posteriormente alcançando o tecido linfoide da nasofaringe de onde há disseminação sistêmica envolvendo vários órgãos O período de incubação varia em média de 8 a 14 dias O exantema surge em média 16 a 18 dias depois do início da infecção é de característica bastante benigna aparecendo inicialmente na face e rapidamente se disseminando para o tronco e extremidades distais As complicações mais comuns incluem artrite artralgia encefalopatia e trombocitopenia Em gestantes é temida por sua capacidade de causar máformação sendo preconizados durante o período prénatal exames sorológicos para avaliação do status sorológico e monitoração das pacientes susceptíveis Em recémnascidos é reconhecidamente a maior causa de surdez não genética Hepatite infecciosa do tipo A vírus da hepatite A HVA Sabese que o HVA se instala primariamente no fígado utilizando o aparelho digestivo como via de entrada sem causar lesão local A hepatite A é transmitida pela via fecaloral e os alimentos e as águas contaminados são os principais veículos de transmissão durante os períodos de epidemias Nos ambientes familiares e institucionais o contato pessoal íntimo pode facilitar o contágio sobretudo pelo compartilhamento de copos e talheres A transmissão por via parenteral sob a forma de transfusão ou uso de fármacos ainda que teoricamente possível não tem sido verificada Os pacientes infectados são transmissores da doença por um período que varia de 2 a 3 semanas antes do aparecimento da icterícia amarelamento típico da pele e das mucosas característico de infecções hepáticas até duas semanas após a regressão desse sintoma A fase ictérica é acompanhada pelo aparecimento de urina escura e fezes descoloradas manifestações claras de excesso de bilirrubina não conjugada na circulação sanguínea bilirrubinemia Essa fase iniciase após até 10 dias depois do aparecimento dos sintomas iniciais A doença é mais leve em crianças do que em adultos e a recuperação em geral é completa não se observando casos de infecção crônica Hepatite infecciosa do tipo B vírus da hepatite B HBV A infecção pelo vírus da hepatite B pode resultar em diversas patologias Mais de 65 a 80 das infecções ocorrem de forma subclínica 20 a 35 ocorrem na forma de doença com icterícia Dos indivíduos infectados 90 a 98 têm recuperação completa e 2 a 10 evoluem para doença crônica Quanto menor for a idade do paciente infectado maior a probabilidade de desenvolvimento de infecção crônica O vírus da hepatite B pode ser transmitido de 3 formas por meio de contato percutâneo com sangue ou produtos de sangue infectados através de contato sexual ou por transmissão perinatal da mãe infectada para a criança Os pacientes infectados de forma crônica apresentam maior chance de desenvolver situações mais graves como o carcinoma hepatocelular A taxa de sobrevivência varia em torno de 25 a 60 dependendo do tamanho do tumor e da sua possibilidade de remoção 130 Unidade III Hepatite infecciosa do tipo C vírus da hepatite C HCV O vírus da hepatite C HCV é transmitido quase que exclusivamente pela exposição parenteral a sangue produtos de sangue e objetos contaminados com sangue A triagem de doadores de sangue quase eliminou a transmissão por essa via embora o risco mais importante atualmente seja a contaminação de seringas compartilhadas por usuários de fármacos injetáveis A transmissão sexual e a perinatal já foram encontradas mas não parecem ser vias de transmissão comuns No entanto importante ressaltar que a prevenção com uso de preservativos e os exames prénatais podem constituir um grande obstáculo à manutenção desse vírus por essas formas de transmissão e por isso precisam ser constantemente divulgadas e reforçadas O período ou fase de incubação da hepatite C ocorre em média de 7 semanas As infecções podem variar desde subclínicas até fulminantes Os sintomas clínicos são semelhantes aos das demais hepatites virais mas raramente ocorrem em mais de um terço dos pacientes Observação Conhecer as características dos vírus sobretudo das hepatites A B e C auxilia e muito no diagnóstico imunológico dessas infecções sobretudo no que envolve a caracterização da fase de doença Retrovírus síndrome da imunodeficiência adquirida aidsHIV A aids é causada pelo HIV Human immunodeficiency virus e é transmitida por meio de relações sexuais sangue contaminado pelo uso de agulhas e seringas contaminadas e transfusão sanguínea e transmissão vertical da mãe para o feto Há comprometimento da resposta imunológica do organismo infectado deixandoo desprotegido e suscetível ao desenvolvimento de múltiplas infecções Diversas características favorecem a propagação do vírus da aids como o fato de o indivíduo infectado não ficar doente logo no início da contaminação ou seja há um período de latência muito grande variando em média de 2 a 7 anos A pessoa por algum tempo pode ter o vírus sem produzir anticorpos detectáveis pelo exame janela imunológica É importante ressaltar que não há evidências de transmissão da aids por meio de fluidos corporais como saliva lágrimas e suor objetos ou ambientes como piscina sanitários sabonetes pratos talheres e copos contato pessoal como aperto de mão abraços e beijos picadas de insetos como mosquitos e pernilongos A infecção aguda pode ser tão discreta a ponto de se confundir com um simples processo gripal ou adquirir dimensões mais graves como alterações neurológicas Após os sintomas iniciais o portador do HIV costuma permanecer assintomático durante vários anos Porém em 5 anos em média começam a surgir os primeiros sinais e sintomas Observase então o aumento generalizado dos linfonodos 131 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA episódios de febre sudorese emagrecimento e diarreia que podem durar de semanas a meses O aparecimento das conhecidas infecções oportunistas ou de neoplasias costuma ocorrer em estágios mais avançados da doença No entanto as infecções oportunistas podem ser as primeiras manifestações clínicas do estado O diagnóstico baseiase na história clínica e na sorologia específica antiHIV Elisa e western blot Até o momento não foi descoberto nenhum medicamento que proporcione cura da doença o tratamento preconizado por meio do uso de vários fármacos apenas prolonga a vida do doente Parvovírus O parvovírus é responsável por infecções de vários animais incluindo cães raposas suínos e outros O Erythrovirus B19 antes descrito como Parvovirus B19 recebeu esse nome por seu tropismo pelas células eritropoéticas Esse é o mais estudado por estar associado em humanos a doenças como o eritema infeccioso a artropatia e a crise aplásica A disseminação do vírus ocorre pelas fezes urina saliva secreções nasais e provavelmente por contato com fluidos genitais Saiba mais O Parvovirus B19 é um Erythrovirus humano com tropismo para as células progenitoras da medula óssea sendo responsável por um grande espectro de manifestações clínicas desde infecções assintomáticas até crises aplásicas graves No artigo recomendado a seguir os autores apresentam o caso de uma mulher de 40 anos com história de anemia ferropênica por menorragias que desenvolveu quadro clínico com febre cefaleias petéquias e posteriormente exantema nas pernas associado à hipoplasia medular com redução transitória da contagem de todas as linhagens celulares hematológicas Leia AGUDO I et al Aplasia medular transitória associada a infecção por Parvovírus B19 Rev Soc Bras Clin Med v 14 n 3 julset 2016 Disponível em httpsbitly36kYcuh Acesso em 1º jul 2021 Papilomavírus A família Papillomaviridae é constituída pelos 16 gêneros incluindo centenas de tipos virais O papilomavírus humano HPV é o mais conhecido sendo o causador de tumores benignos e malignos de pele e das mucosas O desenvolvimento desses tumores depende de vários fatores como tabagismo alcoolismo múltiplos parceiros sexuais início precoce da vida sexual e gravidez principalmente antes dos 18 anos 132 Unidade III A transmissão do HPV ocorre na maioria dos casos pelo contato sexual não precisando necessariamente haver a penetração mas apenas com um contato íntimo Outras formas de contágio menos frequentes podem ocorrer pelo uso de instrumentos ginecológicos não esterilizados compartilhamento de roupas íntimas contaminadas entre outros O diagnóstico pode ser feito por meio de exame clínico e laboratorial como papanicolau colposcopia e biópsia das lesões suspeitas Métodos moleculares como a PCR são os mais adequados para a caracterização dos sorotipos virais Poliomavírus Os poliomavírus humanos BKV e JCV são os membros do gênero poliomavírus As infecções primárias por esses vírus ocorrem principalmente na infância e são geralmente assintomáticas Os vírus podem persistir após a infecção primária na forma latente em vários órgãos especialmente nos rins Em pacientes com deficiência imunológica associada principalmente à aids esses vírus podem ser reativados e causar algumas doenças A reativação do BKV acarreta doenças do trato urinário como a cistite hemorrágica e outras nefrites enquanto a reativação do JCV leva a leucoencefalopatia multifocal progressiva Herpesvírus São vírus extremamente infecciosos porém de característica normalmente benigna Estimase que 97 da população mundial já tenha tido contato com esse vírus e uma grande parte não apresentou sintomas Alguns vírus dessa família podem apresentar neurotropismo levando ao desenvolvimento de encefalites outros são linfotrópicos ou seja possuem afinidade pelos linfócitos o que pode desencadear distúrbios do sistema imunológico causando graves infecções em pacientes imunodeprimidos ou suprimidos como pacientes com aids e transplantados de órgãos e ou de tecidos São descritos oito tipos de vírus herpes subdivididos em famílias como descrito a seguir As subfamílias de herpesvirus são Alfaherpesvirus Herpes simplex vírus 1 e 2 HSV1 e HSV2 causadores da doença vulgarmente conhecida por herpes Vírus da Varicelazoster HHV3 Human herpesvirus 3 também conhecido por cataporazoster no Brasil ver herpeszoster Betaherpesvirus Citomegalovirus ou HCMV Human citomegalovirus ou HHV5 Human Herpesvirus 5 causa um tipo de mononucleose infecciosa Herpesvirus 6 e 7 HHV6 e HHV7 Human herpesvirus 6 e 7 causa da doença infantil infecciosa roséola 133 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Gamaherpesvirus EpsteinBarr virus HHV4 causa a doença do beijo ou mononucleose infecciosa Envolvido na patogênese de alguns cancros como o linfoma de Burkitt e carcinoma de nasofaringe Herpesvírus8 HHV8 Human herpesvirus 8 ou KSHV Kaposis Sarcomaassociated Herpesvirus vírus que pode causar sarcoma de Kaposi hemangiossarcoma ou seja tumor maligno de vasos sanguíneos Flavivirus A família Flaviviridae é composta por três gêneros Hepacivirus Pestivirus e Flavivirus O primeiro gênero tem como única espécie até hoje identificada o vírus da Hepatite C O segundo agrupa os vírus que infectam mamíferos nos humanos com destaque para os 187 vírus da diarreia bovina e o vírus da peste suína Entre eles o vírus da febre amarela o grupo do Dengue virus DENV o grupo do Mammalian tickborne virus TBEV o grupo do Aroa virus AROAV e o grupo do Japanese encephalitis virus JEV Os vírus dessa família possuem como ácido nucleico o RNA de cadeia linear simples polaridade positiva e comprimento médio entre 95 a 123 kd Apresentam capsídeo icosaedro o que lhes confere um aspecto esférico recoberto pelo envelope E as partículas virais possuem um diâmetro com cerca de 40 a 60 nm Os representantes dessa família são considerados arbovírus pois possuem artrópodes como vetor A palavra arbovírus é de origem inglesa arthropodborne virus que significa vírus carregado por um artrópode Os vírus ficam então armazenados no vetor e por vezes proliferam sem causar danos Duas espécies dessa família representam um grande problema de saúde pública no Brasil o vírus da dengue e o vírus da febre amarela Paramixovírus Das doenças causadas pelos vírus dessa família o sarampo constitui uma das mais estudadas e importantes Essa doença pode causar três formas de encefalite infecção direta dos neurônios encefalite pósinfecção que se acredita ser mediada imunologicamente e panencefalite esclerosante subaguda SSPE causada por uma variante defectiva do vírus durante a fase aguda da doença O vírus SSPE age lentamente e causa sintomas e efeitos citopáticos em neurônios muitos anos após a fase aguda da doença O vírus pode ser transmitido desde 5 dias antes até 4 ou 5 dias depois de as lesões de pele manchas vermelhas características da doença aparecerem O período de maior transmissibilidade ocorre 48 horas antes e até 48 horas depois do início dessa manifestação da pele Os sintomas geralmente se manifestam após cerca de 10 dias da infecção A essa altura a pessoa poderá apresentar coriza tosse febre ascendente a cada dia que passa as temperaturas são mais altas conjuntivite manchas vermelhas alguns dias depois aparecem os exantemas ou rash grosseirão com manchas vermelhas Eles se espalham por todo o corpo e começam a partir da parte de trás das 134 Unidade III orelhas e pescoço para depois avançarem para os membros superiores e inferiores braços e pernas e o abdomen Essa fase pode durar 3 4 5 dias mesmo período em que a febre começa a abrandar 72 Prevenção de doenças virais vacinas e drogas antivirais A prevenção de infecções virais não é em absoluto uma tarefa fácil visto que reconhecidamente o único método seguro de evitar a infecção viral é evitar a exposição No entanto sabese que tanto em populações humanas como em animais a exposição aos diferentes tipos de vírus é um fato que estatisticamente e epidemiologicamente não se consegue evitar Diante do que conhecemos sobre epidemiologia de infecções virais sabese que a única forma efetiva de se evitar a doença viral sobretudo a doença grave é a vacinação e para tanto vacinas são desenvolvidas no mundo todo e sobretudo no Brasil a fim de garantir essa proteção Como dito em algumas situações a ocorrência de doença pode ser prevenida por meio de vacinação Embora a vacinação não necessariamente previna a infecção a sensibilização prévia do sistema imunológico permite uma resposta rápida à eliminação do vírus antes que a doença ocorra ou faz com que a doença seja leve de curta duração De fato a vacinação é o método mais efetivo e com melhor relação custobenefício As vacinas precisam ser seguras e para isso não devem causar doença nem morte do indivíduo vacinado As vacinas devem proteger contra a doença resultante da exposição ao vírus e a proteção deve durar muitos anos As vacinas devem como forma de comprovar sua eficácia induzir a formação de anticorpos neutralizantes essenciais para prevenir infecção Além de tudo as vacinas ainda devem ser de baixo custo alta estabilidade fácil administração e provocar nenhum ou poucos efeitos adversos As vacinas podem ser produzidas a partir de antígenos mortos ou inativados Antígenos atenuados subunidades ou hoje e mais atual a partir das tecnologias de DNA recombinante e de vacina vetorial Vacinas inativadas normalmente requerem mais de uma dose para induzir imunidade e revacinações periódicas para manter imunidade adequada As vacinas inativadas geralmente induzem imunidade que é menos protetiva e de duração mais curta que aquela induzida pelas vacinas vivas atenuadas As vantagens das vacinas inativadas não revertem à virulência e são consideradas mais seguras com menor possibilidade de efeitos adversos Um exemplo bastante atual é a vacina para SarsCoV2 denominada de CoronaVac produzida pelo Instituto Butantan em parceria com a farmacêutica de origem chinesa Sinovac Vacinas vivas modificadas consistem por exemplo de vírus tornados menos virulentos por processos clássicos de atenuação em cultura celular por múltiplas passagens em diferentes tipos celulares ovos embrionados animais de laboratório ou por alteração da expressão genômica pela deleção de genes específicos responsáveis pela virulência Vacinas atenuadas geralmente conferem longa imunidade pois a vacinação mimetiza a infecção natural Uma vacina adequadamente atenuada não deve causar doença apesar da possibilidade de efeitos adversos Algumas vacinas vivas atenuadas podem ser administradas pelas vias oral nasal ou genital prepucial vaginal onde irão induzir resposta humoral secretória local IgA 135 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA As vacinas de subunidade são um tipo de vacina inativada que contêm porções proteínas fragmentos do vírus necessários para induzir imunidade Tais porções são conhecidas por serem de alto peso molecular e alta complexidade tendo a condição de estimular de forma adequada uma resposta imune segura e duradoura Um exemplo é a vacina contra o tétano As vacinas recombinantes podem ser divididas em três tipos principais as produzidas a partir de proteínas recombinantes nas quais o gene do antígeno viral de interesse é clonado e o cDNA é introduzido no genoma de bactérias ou leveduras por meio de um plasmídeo que produz a proteína em grandes quantidades sendo esse antígeno posteriormente utilizado como agente imunizante As vacinas vetoriais são aquelas em que o gene de um vírus grande geralmente um poxvírus adenovírus ou herpesvírus é deletado e substituído por um gene que codifica o antígeno desejado o vírus que carrega o gene do antígeno desejado é chamado de vetor Um exemplo bastante recente dessa tecnologia é a produção e distribuição de vacinas para a prevenção do SarsCoV2 as quais utilizam um adenovírus como vetor sendo elas a vacina da OxfordAstraZeneca a da Janssen e a vacina Sputnik V do Instituto Gamaleya da Rússia As vacinas com deleções de genes são aquelas em que um vírus com alto potencial de virulência é modificado a um status menos virulento pela deleção de genes ou pela substituição de regiõeschave nos genes com outro material genético Várias vacinas recombinantes estão sendo usadas incluindo a proteína do vírus da hepatite B expressa em levedura proteína do vírus da raiva expressa no vírus da vaccínia As drogas antivirais são uma alternativa extremamente importante sobretudo quando o paciente se encontra em uma condição em que requer tratamento efetivo e ostensivo Vários aspectos sobre a terapia antiviral acabaram por ser revisitados e muitos conceitos novos assim como novos medicamentos surgiram com o incremento da terapia sobretudo em pacientes HIV soropositivos um exemplo do quão eficaz pode ser um tratamento e o quanto isso altera de forma significativa o curso de uma doença As drogas antivirais podem ser classificadas em duas categorias principais de acordo com o seu mecanismo de ação Conhecidas como análogas de nucleosídeos e não análogas de nucleosídeos cujas principais características e diferenças serão discutidas a seguir Nucleosídeos inibidores várias drogas antivirais comerciais são análogas de basesnucleosídeos que interferem com a ação das polimerases de ácido nucleico virais Os mais comuns são acicloguanosina Aciclovir dihidroxipropoximetilguanina Ganciclovir adenina arabinosida Vidarabine e azidotimidina Zidovudine Inibidores não nucleosídeos interferons e drogas antivirais têm sido utilizados para o tratamento de algumas infecções virais específicas Os interferons possuem função antiviral importante pois aparecem cedo na infecção e desempenham um papel importante na recuperação O mecanismo de ação é a inibição da síntese de proteínas virais Além dos interferons IFN outras drogas que inibem a tradução de RNAm virais são a fomiversina e metisazona A fomiversina Vitravene é uma molécula de DNA antissentido que bloqueia a replicação do citomegalovírus A metisazona Nmetilbetatiosemicarbazone é específica para RNAm dos poxvírus A amantadina Symmetrel e rimantadina Flumadine interferem com a penetração eou desnudamento de alguns vírus envelopados mas é eficaz apenas contra o vírus da influenza A em humanos Essas drogas 136 Unidade III não são comumente utilizadas nos EUA Saquinavir Invirase indinavir Crixivan ritonavir Norvir e nelfinavir Viracept são inibidores de proteases virais Elas atuam ligandose no sítio ativo das proteases impedindo a enzima de clivar outras proteínas Essas drogas são frequentemente utilizadas como parte do coquetel de drogas no tratamento do HIV em humanos Zanamivir Relenza e oseltamivir Tamiflu inibem a liberação do vírus das células hospedeiras São específicos para a proteína neuraminidase do vírus da influenza impedem a liberação do vírus e portanto limitam sua disseminação Um exemplo importante e eficaz de terapia antiviral foi aquela instituída a partir de 1997 denominada de Haart terapia antirretroviral de alta atividade para tratamento de pacientes infectados pelo vírus HIV A Haart desde sua introdução mostrou que consegue promover uma redução da carga viral e imunossupressão diminui transmissão perinatal e aumenta a sobrevivência A Haart consiste em um coquetel de medicamentos que atuam em diferentes etapas da replicação viral portanto esse coquetel é formado por drogas inibidoras da fusão e entrada do vírus nas célulasalvo inibidores de transcriptase reversa inibidores de integrase inibidores de protease e inibidores da zincfinger Lembrete Os fármacos antivirais atuam interrompendo o processo infeccioso Dependendo do vírus e do medicamento o processo de bloqueio pode ocorrer em muitos locais diferentes Às vezes são usados vários medicamentos para tratar uma infecção específica para que mais de um processo viral seja interrompido e as chances de o paciente recuperarse da infecção aumentem Saiba mais A síndrome da imunodeficiência adquirida aids sigla em inglês é causada por infecção pelo retrovírus vírus da imunodeficiência humana HIV Uma etapachave no ciclo de vida do HIV é a síntese de uma cópia em DNA do RNA do genoma viral catalisada por uma enzima chamada transcriptase reversa A transcriptase reversa é um importante alvo terapêutico pois não é essencial para as células normais e não faz revisão portanto sua taxa de erro é muito maior do que a das DNA polimerases celulares Em função disso há um aumento do número de mutantes na população viral em um mesmo paciente É provável que alguns desses mutantes sejam resistentes a um dado agente terapêutico Desde a introdução da terapia antirretroviral altamente ativa Haart em 1996 temse observado em todo o mundo mudanças nas causas de hospitalização em pacientes com HIVaids Sobre o assunto leia NUNES A Análise do perfil de pacientes com HIVaids hospitalizados após introdução da terapia antirretroviral Haart Ciênc saúde colet v 20 n 10 out 2015 137 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA 8 DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS Para o diagnóstico de infecções virais podemos utilizar de diferentes metodologias algumas consideradas clássicas ou já em desuso e outras consideradas técnicas modernas como as de biologia molecular Para que se tenha uma percepção clara do que envolve o diagnóstico de infecções virais a seguir discutiremos as principais técnicas utilizadas dividindoas em técnicas clássicas sorológicas e moleculares Porém antes de discutirmos sobre as principais técnicas aplicadas ao diagnóstico virológico é importante compreendermos algumas problemáticas que envolvem as infecções virais e seu diagnóstico Note a seguir os cinco princípios das doenças virais I Muitas infecções virais são subclínicas II A mesma doença pode ser produzida por uma variedade de vírus III O mesmo vírus pode provocar uma variedade de doenças IV A doença produzida não tem relação com a morfologia viral V A evolução de qualquer caso é determinada pela constituição genética do vírus e do hospedeiro Ao analisarmos esses cinco princípios compreendemos que grande parte das infecções é assintomática o que de antemão propõenos uma maior dificuldade em estabelecer diagnóstico em situações em que nem sequer existem sintomas Também importante salientar que em grande parte as chamadas viroses podem não ser viroses sugerindo por vezes diagnóstico errôneo do corpo clínico Outra questão bastante importante é que diferentes vírus podem causar uma mesma doença e um vírus pode causar diferentes doenças aumentando ainda mais a possibilidade de erro no diagnóstico Outras questões também devem ser observadas quando do diagnóstico de uma infecção viral e que norteiam sobretudo a escolha dos métodos que serão utilizados a saber Podem ocorrer infecções duplas Diferentes vírus podem ter a mesma ocorrência sazonal e geográfica Pode ocorrer infecção inaparente por um vírus e clínica por outro Muitos vírus são facilmente isolados durante os primeiros dias da doença Observação O conhecimento sobre as questões que envolvem o quadro clínico do paciente é essencial para que o profissional de laboratório possa escolher os métodos que serão utilizados a fim de diagnosticar uma possível infecção viral 138 Unidade III 81 Técnicas clássicas em virologia Cultivo e isolamento viral Para o isolamento caracterização identificação e até mesmo com o objetivo de alcançar a produção de vacinas uma considerável quantidade de partículas virais é normalmente necessária assim também a capacidade do isolamento de um vírus a partir de uma material biológico requer grande trabalho e procedimentos bem estabelecidos Tudo isso pode ser obtido por meio de técnicas de propagação entre as quais podemos destacar a inoculação em animais inoculação em ovos embrionados cultura de células e tecidos e cultivo de explante A inoculação de animais durante muito tempo foi a única maneira de se obterem grandes quantidades de vírus Atualmente o uso de animais para multiplicação de vírus é limitado devido a questões éticas Somente são utilizados animais para a amplificação viral para aqueles vírus que apresentam dificuldade de adaptação ao cultivo celular in vitro A inoculação de ovos embrionados foi umas das primeiras alternativas na qual não se utilizava animais sendo um método amplamente utilizado para a propagação de vírus influenza tipo A e produção de vacinas visando sobretudo a atenuação de vírus em que a constante passagem por ovos embrionados promove uma alteração dos fatores de virulência sendo portanto utilizadas nas vacinas vivas atenuadas como no caso da vacina da gripe A cultura de células e tecidos referese ao crescimento e manutenção de células e tecidos vivos in vitro Existem dois tipos básicos cultivo de explante e cultivo celular Cultivo de explantes são pequenos fragmentos de tecidos oriundos do hospedeiro e mantidos em cultivo enquanto que o cultivo celular é resultado da dissociação do tecido em células individuais seguido de sua manutenção em cultivo O cultivo de células utilizase de diferentes linhagens celulares especificas como hep hela fibroblasto humano rim de macacorhesus ou células Vero rim de macaco verde africano Essas células devem ser de fácil manutenção a fim de propiciar uma utilização continua A existência de um vírus em uma cultura celular é notada pela presença de efeitos citopáticos característicos lise necrose inclusões vacuolização sincícios aparecimento de proteínas codificadas por vírus por exemplo pp64 CMV Visualização e caracterização da partícula viral Os dois métodos mais utilizados para visualizar a estrutura e morfologia dos vírus são a microscopia eletrônica e microscopia de força atômica Outros tipos de microscopia são empregados para observar as alterações celulares induzidas pela replicação viral Sem as técnicas de visualização dos vírus existe uma dificuldade muito grande em se estudar a estrutura ou a interação víruscélula A capacidade de visualização das partículas permitiu estimar o número de partículas presentes em uma suspensão Alguns métodos permitem quantificar o número de partículas presentes em uma solução de forma indireta Em ambos os casos direta ou indireta a quantificação é sempre uma estimativa A estimativa é importante na preparação de vacinas na determinação do número mínimo para produção de doença ou em investigação viral 139 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Com o uso da microscopia óptica comum não é possível a observação das partículas virais No entanto podese observar a formação de efeitos citopáticos característicos da presença de vírus em células cultivadas e mantidas em laboratório Os efeitos citopáticos observáveis quando em cultura normalmente incluem I Arredondamento celular e agregados semelhantes a cachos de uva Exemplo adenovírus II Arredondamento celular retração celular ruptura com a liberação de debris celulares Exemplo enterovírus III Entumecimento e arredondamento celular em áreas localizadas Exemplo herpesvirus IV Fusão de várias células e formação de células gigantes multinucleadas sincício Exemplo paramixovírus Adicionalmente a formação de corpúsculos de inclusão pode ser observada sendo características de alguns vírus como no caso do vírus da raiva ou na citomegalovirose Figura 67 Efeito citopático do sarampo em caso de encefalite note células grandes e arredondadas Fonte httpsbitly2Ultdes Acesso em 1º julho 2021 A microscopia de fluorescência pode ser utilizada para a visualização de células ou tecidos infectados por vírus Nesse caso empregamse anticorpos específicos para determinados antígenos normalmente associados a um fluorocromo geralmente fluoresceína Figura 68 Imunofluorescência positiva para a presença de vírus Fonte UFRN sd 140 Unidade III A microscopia eletrônica emprega a aceleração dos elétrons com grande energia magnética tornando possível a visualização da amostra Os elétrons com alta energia possuem comprimentos de ondas curtos e isso faz com se obtenha uma melhor resolução de estruturas muito pequenas A microscopia eletrônica possui resolução capaz de se visualizarem grandes polímeros como DNA RNA e grandes proteínas Para facilitar a visualização as amostras podem ser previamente tratadas com metais pesados como o ósmio Os elétrons chocam com o metal os quais são visualizados na tela fluorescente Com microscopia eletrônica é possível a obtenção de imagens tridimensionais dos vírus e de sua localização dentro da célula hospedeira núcleo ou citoplasma em um determinado momento após a infeção Como as amostras são tratadas com metais pesados a observação dos vírus em células vivas não é possível Figura 69 Microscopia eletrônica do coronavírus Disponível em httpsbitly3xef95b Acesso em 1º jul 2021 Adaptada A microscopia de atômica de força mede a propriedades locais tamanho absorção magnetismo etc mediante a proximidade da sonda com a amostra Isso faz com que seja possível medir pequenas áreas da amostra Os elétrons são impulsionados entre os átomos resultando em uma pequena mas mensurável força O resultado da força medida é transformado no contorno da superfície da estrutura analisada A vantagem da microscopia atômica de força é o uso de células ou tecidos vivos e de requerer uma quantidade mínima de amostra Esse método tem sido útil para imagens detalhadas de estruturas de capsídeos e de interações entre o vírus e a célula 141 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA 82 Técnicas moleculares em virologia Reação de polimerização em cadeia PCR A reação em cadeia da polimerase PCR polimerase chain reaction é considerada uma técnica de biologia molecular revolucionária Desenvolvida por Kary Banks Mullis prêmio Nobel de química de 1993 em abril de 1983 essa técnica consiste na síntese enzimática de cópias de ácidos nucleicos A PCR apresenta ampla gama de aplicações em vários ramos da pesquisa científica e diagnóstico e é muito utilizada no diagnóstico de infecções virais A utilização da PCR permite que uma determinada região do genoma de qualquer organismo possa ser amplificada e multiplicada em milhões de cópias Os elementos envolvidos na reação de PCR basicamente são os mesmos presentes no processo de replicação que ocorre nas células Para que seja possível o processo de amplificação de um segmento de DNA especifico é necessário que as extremidades da sequência de pares de bases sejam conhecidas Os iniciadores ou primers que delimitam e são complementares à região alvo de amplificação apresentam cerca de 15 a 25 nucleotídeos de extensão Os primers são projetados de modo que um é complementar ao filamento de uma molécula de DNA em um lado da sequência alvo e o outro é complementar ao outro filamento da molécula de DNA no lado oposto da sequência alvo Para que ocorra a PCR é necessária a presença dos seguintes componentes DNA genômico total ou uma população de cena DNA polimerase termoestável primers tampão 10 mm TrisHl pH 83 50 mm kcal cloreto de magnésio cofator da reação e nucleotídeos necessários para a síntese das novas fitas de DNA dNTPs dATPs dTTPs dCTPs e dGTPs Durante o procedimento as amostras devem ser submetidas à combinação adequada de temperatura e de tempo Cada ciclo da PCR apresenta três fases fundamentais desnaturação anulamento e extensão A desnaturação ocorre por meio da elevação da temperatura para cerca de 94 a 95 C Nessa fase o DNA perde sua estrutura de dupla hélice separando as duas fitas Dessa forma o DNA e os primers podem se ligar à região complementar a sua sequência na fita simples que foi exposta Uma vez desnaturado o DNA a temperatura da reação é reduzida para a temperatura de anulamento 50 a 70 C e ocorre o pareamento dos primers por meio de ligações de hidrogênio ao DNA alvo de fita simples A temperatura de anulamento é sempre específica para cada par de primers e depende da quantidade de citosina e guanina da sequência a ser amplificada A última etapa do processo é a extensão Nesse momento a temperatura é elevada até cerca de 72 ºC para que a enzima DNA polimerase TaqDNApolimerase se posicione junto dos primers que se anelaram anteriormente e seja iniciada a síntese da cadeia complementar A síntese da nova fita de DNA se inicia a partir dos primers ou iniciadores A enzima DNA polimerase catalisa a reação que insere os nucleotídeos dNTPs complementares à fitamolde Dessa maneira novas fitas de DNA de dupla hélice são formadas correspondentes à região alvo de amplificação delimitada pelos primers A figura a seguir esquematiza as etapas de um ciclo da PCR 142 Unidade III Primeiro ciclo de amplificação Produtos do primeiro ciclo DNA polimerase dATP dGTP dCTP dTTP Etapa 3 Síntese de DNA Região do DNA de fita dupla a ser amplificada 5 5 5 3 3 3 3 3 3 5 5 5 Etapa 1 Aquecer para separar as fitas Etapa 2 Resfriar para anelar os iniciadores Par de iniciadores Figura 70 Ciclo de PCR Cada ciclo da PCR inclui três etapas o DNA de fita dupla é aquecido brevemente para separar as duas fitas o DNA é exposto a uma quantidade excessiva de um par de iniciadores específicos projetados para limitar a região do DNA a ser amplificada e a amostra é resfriada para permitir que os iniciadores hibridizem com as sequências complementares nas duas fitas de DNA essa mistura é incubada com DNApolimerase de modo que o DNA possa ser sintetizado a partir dos dois iniciadores Para amplificar o DNA o ciclo é repetido muitas vezes por meio do reaquecimento da amostra para separar as fitas de DNA recémsintetizadas O processo de desnaturação anulamento e extensão é repetido várias vezes até que se obtenha grande quantidade do DNA a ser amplificado Os filamentos de DNA recémsintetizados mesmo complementares formam uma segunda cópia da sequência alvo original gerando assim uma amplificação exponencial 2 4 8 16 32 cópias A PCR é uma reação em cadeia pois as fitas de DNA recentemente sintetizadas atuarão como molde para mais uma síntese de DNA nos ciclos subsequentes Após cerca de 25 ciclos de síntese de DNA os produtos da PCR incluem além do DNA que iniciou a reação cerca de 105 cópias da sequência alvo especifica Na PCR convencional para visualização do produto da reação também chamado de amplicon é necessário realizar uma eletroforese e os resultados são qualitativos Além da análise do DNA pequenas amostras de RNA podem ser analisadas pela reação em cadeia da polimerase Nesse caso é utilizada a RTPCR uma reação da transcriptase reversa seguida de PCR A partir do RNA fita simples a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar chamada de cDNA Ao cDNA aplicase a técnica de PCR Uma vez que analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas a RTPCR é amplamente utilizada para verificar a expressão gênica PCR em tempo real Derivada da PCR convencional a PCR em tempo real é uma inovação tecnológica e vem conquistando espaço nos diagnósticos clínicos e nos laboratórios de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos além de ser mais rápida e precisa quando comparada à PCR convencional que apresenta resultados qualitativos O método original de PCR apresenta algumas limitações sérias ao amplificar primeiro a sequência de DNA e depois analisar o produto a quantificação era extremamente difícil uma vez que independentemente da quantidade inicial de moléculas de DNA ao fim de toda a reação era originada essencialmente a mesma quantidade de produto Essa limitação foi resolvida em 1992 pelo desenvolvimento da PCR em tempo real 143 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Na PCR em tempo real o produto formado é monitorado durante o curso da reação A fluorescência de corantes ou sondas introduzidas na reação é monitorada em tempo real e é proporcional à quantidade de produto formado e ao número de ciclos de amplificação necessários para obter a amostra A quantificação desses materiais ocorre com maior precisão e com maior reprodutibilidade uma vez que os valores são determinados na fase exponencial da reação Assumindo que a amplificação ocorra com eficiência que normalmente é quase uma duplicação do número de moléculas por ciclo de amplificação é possível calcular o número de moléculas de DNA da sequência amplificada que estavam inicialmente presentes na amostra A principal característica da PCR em tempo real é a sua capacidade de monitorar o progresso da PCR enquanto ocorre a reação e os dados são coletados ao longo dos ciclos A detecção da formação das ampliações ocorre por meio de ampliações com sistema ótico para a captação da fluorescência em um computador com um software para aquisição de dados e análise da reação Existe grande variedade e fabricantes desses equipamentos que apresentam diferenças quanto à capacidade da amostra ao método de captação da fluorescência à sensibilidade e aos softwares para a análise dos dados Os usos típicos da PCR em tempo real incluem quantificação e análise de patógenos viral bacteriana ou de protozoários análise de expressão gênica análise de polimorfismo de nucleotídeo único SNP análise de produtos transgênicos análise de aberrações cromossômicas e mais recentemente também detecção de proteínas por PCR em tempo real Saiba mais Os recentes surtos epidêmicos de doenças emergentes e reemergentes têm demonstrado a importância da aplicação de medidas de controle e prevenção Para que tais medidas sejam eficazes o desenvolvimento de métodos de diagnóstico acurados é essencial Os métodos decorrentes do aprimoramento da biologia molecular e celular têm propiciado a utilização de técnicas diagnósticas que produzem um resultado confiável em poucos minutos ou horas Os ensaios imunocromatográficos a PCR e suas variações a tecnologia de micro arranjos de DNA a citometria de fluxo e a análise do proteoma constituem exemplo Leia CAVALCANTI M BARROS V GOMER Y Avanços biotecnológicos para o diagnóstico das doenças infecciosas e parasitárias Revista de Patologia Tropical v 37 n 1 p 114 janabr 2008 Disponível em httpsbitly3dxjgRW Acesso em 1º jul 2021 144 Unidade III 83 Técnicas imunosorológicas aplicadas em virologia Serão descritos a seguir diversos métodos utilizados em imunologia clínica que possuem características semelhante como utilizar da formação do complexo antígenoanticorpo para quantificar a presença de diferentes analitos Contudo esses métodos têm várias diferenças na sua constituição e finalidade do uso por isso para melhor entendimento de cada método e seus princípios eles serão divididos em não marcados e marcados Os métodos não marcados são mais simples Eles quantificam antígenos e anticorpos apenas pela formação dos complexos imunes São as imunoprecipitações as aglutinações e os ensaios líticos Já os métodos marcados têm um antígeno ou anticorpo marcado ou seja que estará conjugado com uma molécula o que é capaz de aumentar a sensibilidade e a visualização das reações As técnicas marcadas são mais modernas e conseguem detectar menores concentrações do analito nas amostras Os conjugados utilizados podem ser enzimas isótopos radioativos ou fluoróforos Os métodos são nomeados de ensaio imunoenzimático Elisa radioimunoensaio RIA e imunofluorescência IFA Todas as técnicas descritas a seguir sobretudo as técnicas marcadas podem ser utilizadas no diagnóstico de inúmeras doenças de etiologia viral Imunoprecipitação As técnicas de imunoprecipitações permitem identificar e quantificar semiquantitativamente as precipitações que ocorrem com a formação de complexos imunes que são ligações de antígenos a anticorpos Nessa técnica que foi observada pela primeira vez em 1897 por Rodolf Kraus vai ocorrer a mistura de antígenos e anticorpos solúveis que preferencialmente devem ter antígenos multivalentes quanto ao número de epítopos e os anticorpos devem ser policlonais Para anticorpos monoclonais é essencial que o epítopo esteja em uma posição acessível e em grande concentração no antígeno ao qual o anticorpo se ligará A formação dos imunocomplexos vai acontecer com uma mistura de um antígeno solúvel com um anticorpo até que o número de ligação se torne grande o suficiente e com isso insolúvel que precipita Os anticorpos em solução vão precipitar com a adição gradual de antígenos solúveis na mistura No início da adição haverá excesso de anticorpos na reação e com isso as ligações em poucos antígenos não serão suficientes para formarem imunocomplexos para a precipitação é a zona de excesso de anticorpos Com a adição de mais antígenos será atingida a concentração equivalente entre as duas moléculas o que vai permitir a formação de complexo imune e a máxima precipitação é a zona de equivalência Contudo quando houver o excesso de antígenos um anticorpo ficará ligado em suas duas regiões Fab não ocorrendo a formação do imunocomplexo diminuindo a precipitação é a zona de excesso de antígenos 145 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Ac Ag Excesso Ag Excesso Ac Concentração do analito Imunoprecipitação Figura 71 Imunoprecipitação A adição de antígeno solúvel em uma mistura de anticorpos irá permitir a formação de imunocomplexos insolúveis que irão precipitar No início na zona de excesso de anticorpos haverá pouca precipitação Na zona de equivalência ocorre a formação de muito complexo imune havendo muita precipitação Na zona de excesso de antígeno novamente a formação de imunocomplexo é comprometida diminuindo a precipitação Porém a visualização do imunoprecipitado em meio líquido é difícil pois já há uma turvação e coloração natural das amostras que é variável Por essa razão é uma metodologia de difícil padronização mas esse inconveniente é resolvido pelas possibilidades de utilizar esse princípio nas técnicas de automação que são os métodos de nefelometria e turbidimetria muito mais sensíveis do que o olho humano e são capazes de corrigir ou anular os interferentes inerentes das amostras Imunodifusão As técnicas de imunodifusões são aquelas em que substâncias solúveis se difundem ao acaso em meios gelificados como a agarose ou o ágar Essas moléculas livres se movimentam até encontrarem o seu ligante e formarem o imunocomplexo insolúvel que vai se precipitar no gel ficando imobilizado permitindo a visualização como uma turvação Assim como na imunoprecipitação líquida as imunodifusões possuem vários interferentes os já citados anteriormente e principalmente a pureza dos reagentes e a distribuição homogênea dos componentes no gel Existem quatro técnicas de imunodifusão Simples um componente está fixo no gel e o outro solúvel Dupla os dois elementos são móveis e migram simultaneamente Linear ou unidimensional uma corrente elétrica direciona a migração Radial o movimento ocorre em todas as direções Na imunodifusão simples descrita por Oudin em 1946 o anticorpo é adicionado na fase gelificada que é sólida em um tubo e o antígeno é adicionado no topo da coluna Depois os tubos deverão ser vedados e mantidos em temperatura constante Depois de aproximadamente sete dias será possível 146 Unidade III observar se ocorreu a formação do imunocomplexo pela visualização de turvação Nesses ensaios a concentração de antígeno será proporcional à espessura da linha de turvação formada assim como a distância percorrida pelo antígeno até a formação do imunocomplexo A imunodifusão simples pode ser do tipo radial descrita em 1965 por Carbonara e Heremans Nessa técnica uma quantidade fixa de anticorpo específico é adicionada em meio que é gelificado Depois serão realizados orifícios sobre a superfície desse gel onde são adicionados os antígenos a serem testados além de uma amostra controle com o antígeno de interesse em concentração conhecida O antígeno vai se difundir no gel até encontrar com anticorpos formando o imunocomplexo porém se uma grande quantidade de antígeno chegar à região terá a zona de excesso de antígeno Com isso os imunocomplexos se desfazem migram mais encontram novos anticorpos e precipitam novamente Somente quando o antígeno estiver na zona de equivalência haverá a precipitação dos imunocomplexos e turvação do gel Ao redor do orifício no local em que há precipitação vai se formar um halo que quanto mais distante do centro maior será a concentração de antígeno É uma técnica utilizada para quantificação de proteínas de fase aguda e de imunoglobulinas A sensibilidade dessa técnica é de aproximadamente 10 μgdl Além disso exige uma rigorosa padronização das condições e dos reagentes usados Pode ser usada para quantificação desde que seja realizada uma curva padrão com o antígeno controle com a implementação de técnicas de automação de nefelometria e turbidimetria O método que demorava até 72 horas pode ser realizado em alguns minutos Aglutinação Os ensaios imunológicos de aglutinação partem do princípio de que é possível aglutinar partículas com a formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos com partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície A aglutinação vai acontecer em dois estágios No primeiro uma mistura das partículas insolúveis recobertas pelos antígenos vai se ligar com os anticorpos No segundo estágio como resultado das colisões que ocorrem entre essas partículas os anticorpos já ligados a uma partícula se ligam a determinantes antigênicos de outra formando agregados que serão visualizados figura seguinte 147 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Complexo aglutinado Látex sensibilizado com anticorpo Antígeno A B Anticorpo Figura 72 As duas etapas da aglutinação Primeiro irá ocorrer a ligação do antígeno ao anticorpo para a posterior ligação entre as partículas a aglutinação ocorre por antígeno livre A a aglutinação ocorre por anticorpo livre B Como está ilustrado na figura anterior a caraterística principal da aglutinação que se diferencia da técnica de precipitação é a presença de uma partícula insolúvel que será o suporte para a reação Essas partículas ao se ligarem a um componente livre que pode ser antígeno ou anticorpo formarão uma rede tridimensional que aglutinará Essas partículas insolúveis podem ser partículas que apresentam antígenos naturais em sua superfície como as hemácias bactérias protozoários entre outros Partículas inertes látex poliestirenos cristais de colesterol Células antigenicamente não relacionadas às quais se adsorvem ou se fixam antígenos insolúveis como hemácias e bactérias Vários fatores podem interferir no ensaio por isso é importante saber o tipo do anticorpo que estará presente pois o IgM se liga muito mais facilmente aos antígenos do que o IgG Logo quando se deseja detectar apenas os IgG será necessário utilizar reagentes que neutralizam o IgM como o 2mercaptoetanol As técnicas de aglutinação podem ser divididas em direta passiva ou indireta inibição da aglutinação e floculação dependendo das etapas que ocorrem para a formação do aglutinado Na aglutinação direta são utilizadas partículas antigênicas insolúveis em sua forma íntegra ou fragmentada Essas partículas podem ser hemácias bactérias fungos protozoários e vírus os quais possuem antígenos em sua superfície de forma natural por isso podem ser aglutinados diretamente pelo anticorpo Para a aglutinação acontecer é utilizado um antissoro que é uma solução de anticorpos específicos Após um período de incubação a adição do antissoro vai permitir a formação da aglutinação completa 148 Unidade III Por isso é uma técnica de detecção de antígenos Quando o resultado for positivo ele geralmente é expresso como um título que corresponde à diluição usada do antissoro o resultado será a máxima diluição em que ocorrer a aglutinação Em 1951 Boyden verificou que proteínas podem ser adsorvidas em hemácias quando tratadas com ácido tânico Essas células poderiam aglutinarse com anticorpos específicos o que permitiria a detecção de presença de anticorpos em uma amostra contra antígenos Para a realização dessa técnica que utiliza a hemácia como a partícula insolúvel a aglutinação indireta é nomeada de hemaglutinação passiva É uma técnica de simples execução não exige a utilização de nenhum equipamento especial Como esse método é comumente utilizado para a detecção de anticorpos de algumas doenças como Chagas toxoplasmose entre outras a amostra de escolha é o soro Apesar das facilidades é necessária sempre a realização juntamente com o teste de um controle positivo e um negativo garantindo a confiabilidade do resultado obtido O uso de diluição seriada da amostra de soro testada permite a realização de uma semiquantificação da presença do analito investigado ou seja terá como resultado um título de reação que representa a diluição máxima em que há anticorpos presentes na amostra Quanto maior a diluição em que ocorrer a reação positiva maior é a concentração de anticorpos na amostra Para que seja possível visualizar a reação de aglutinação é preciso realizar o ensaio em uma placa própria que possui o fundo em V Lembrando que quando a reação de aglutinação ocorre há a formação de uma rede tridimensional O resultado positivo será visualizado como um tapete já o resultado negativo será observado com a presença da formação de um botão Esse botão nada mais é do que as hemácias livres que não se ligaram a anticorpos sedimentadas no fundo do poço figura seguinte Um exemplo prático da utilização da técnica de aglutinação é para o diagnóstico de diarreia eou disenteria em crianças suspeitas de infecção por rotavírus Neste caso colhese uma amostra de fezes contendo supostamente as partículas do vírus e utilizando de monoclonais específicos detectase por método de aglutinação a presença dele Figura 73 Resultados da hemaglutinação À esquerda resultado positivo há a formação de um tapete no fundo do poço em V devido à ligação de anticorpos nas hemácias formando um complexo uma rede tridimensional À direita resultado negativo na ausência de ligação de anticorpos aos antígenos as hemácias livres sedimentam Adaptada de Montassier sd 149 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Por ser um teste semiquantitativo esse método sempre é realizado com o soro diluído em diferentes títulos A positivação em diferentes diluições permite dizer se há pouco ou muito anticorpo na amostra testada Além disso a diluição da amostra elimina a ocorrência do efeito prozona que é quando o resultado é falsamente negativo FN devido à reação estar acontecendo na zona de excesso de anticorpos Nesses casos a amostra possui muitos anticorpos mas como todas as regiões Fab ficam ligadas por antígenos e vários anticorpos ficarão livres não é possível haver a ligação entre as hemácias consequentemente a amostra que é positiva não vai formar complexo imune A diluição do soro consegue resolver esse falso negativo pois vai fazer com que a reação aconteça na zona de equivalência em um título maior sendo possível visualizar o resultado positivo Paciente Título 12 116 1128 11024 14 132 1256 Pos 18 164 1512 Neg 1 64 2 8 3 512 4 2 5 32 6 128 7 32 8 4 Figura 74 Título de positividade da hemaglutinação Na figura anterior todas as amostras estão positivas porém a amostra que possui maior concentração de anticorpos é a 3 que foi positiva até o título de diluição 1512 já a que possui menos concentração de anticorpos é a 8 que deu positivo apenas até a diluição 18 A amostra 6 é a representação do efeito prozona as primeiras duas diluições são falsamente negativas por ter excesso de anticorpo quando a amostra é diluída a reação acontece na zona de equivalência e se torna positiva A hemaglutinação indireta é usada para a detecção de anticorpos contra vários parasitas entre eles anticorpos de Trypanosoma cruzi Toxoplasma gondii e Treponema pallidum As hemácias utilizadas como suporte da reação antígenoanticorpo são de baixo custo fácil de serem obtidas e mantidas permitem a ligação de vários antígenos e podem ser suspensas em soluções estabilizadoras que evitam reações inespecíficas As hemácias utilizadas preferencialmente são de aves e antígenos de polissacarídeos que se ligam prontamente a essas hemácias Já os proteicos precisam de tratamento com ácido tânico ou cloreto de cromo Quanto mais puros maior a sensibilidade e especificidade do sistema mas mesmo com antígenos purificados é necessário tratar a amostra ou seja o soro do paciente com soluções que extinguam as IgM Comumente é usado o mercaptoetanol para quantificar apenas as IgG Caso não 150 Unidade III haja o tratamento da amostra será quantificado qualquer anticorpo contra o antígeno em questão independentemente da classe Outra aplicação de hemácia como suporte para a aglutinação é usálas para a detecção de pequenas quantidades de antígenos solúveis haptenos ou anticorpos que competem com a substância na qual a hemácia foi sensibilizada É um teste de competição pelo anticorpo no qual a reação de aglutinação será inibida na presença do analito na amostra inibição da hemaglutinação passiva A aplicação dessa técnica é para detectar a presença de antígenos da hepatite e da hemofilia Apesar da aplicabilidade dos ensaios não marcados que foram apresentados anteriormente muitas vezes a eficácia e a confiabilidade do ensaio não podem ser asseguradas pois nem sempre é possível realizar a visualização sem a ajuda de equipamentos da formação do complexo imune in vitro Porém devido aos avanços tecnológicos pelos quais desde 1950 é possível detectar com maior sensibilidade e especificidade a formação dos complexos imunes com o uso da conjugação de moléculas aos componentes dos testes a detecção das reações imunológicas ficou mais fácil de ser mensurada A conjugação é a ligação de um componente de forma covalente a uma molécula do teste que será uma proteína que pode ser tanto um antígeno como um anticorpo A ligação do conjugado deve ser realizada de uma forma que mantenha a funcionalidade das moléculas As moléculas que podem ser utilizadas como conjugados são fluorocromos radioisótopos substâncias luminescentes enzimas com diferentes substratos podendo ser fluorescente cromogênicos ou luminescentes A ligação do conjugado pode ser realizada tanto em antígenos purificados como naqueles produzidos por recombinação genética Já os anticorpos que serão conjugados podem ser monoclonais ou policlonais independentemente de qual é a molécula que será conjugada Quanto maior o seu grau de pureza maior será a eficiência do teste em questão Além de propiciar uma maior eficácia e confiabilidade aos testes as marcações permitiram o desenvolvimento de diversos sistemas de automação Lembrete As técnicas não marcadas são tidas como menos específicas e portanto seu uso vem caindo em desuso mas vale a pena lembrar que ainda em laboratórios de pequeno porte tais metodologias ainda são uma alternativa viável para que se possa dar atendimento a populações menos favorecidas Imunofluorescência Os ensaios que empregam o uso de fluorocromos permitem a ligação do conjugado em antígenos ou em anticorpos Essas moléculas vão emitir fluorescência quando estimuladas em um determinado comprimento de onda pois a molécula fluorescente absorve uma grande quantidade de energia elevando o nível de energia nos seus elétrons que quando retornam ao nível basal emitem luz a fluorescência em um comprimento de onda maior A emissão dessa luz poderá ser observada em um microscópio de fluorescência 151 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Por usarem fluorescência ligados a antígenos ou anticorpos os ensaios são nomeados de imunofluorescência Podem ser do método competitivo ou não competitivo homogêneos ou heterogêneos ou ainda realizados em fase líquida ou sólida As técnicas de fluorescência ainda são utilizadas em laboratório de diagnóstico contudo vêm sendo substituídas pelas técnicas imunoenzimáticas pois para a visualização da fluorescência é necessário o uso de microscópios próprios Porém em laboratórios de pesquisa a imunofluorescência ainda é amplamente utilizada já que permite uma grande variabilidade de aplicações para um mesmo método A detecção de um antígeno diretamente em uma célula ou em um tecido é realizada pelo método da imunofluorescência direta A única limitação do teste é a necessidade de utilizar um anticorpo monoclonal conjugado para cada antígeno que se desejar detectar A utilização de imunofluorescência direta é feita em imunohistoquímicas pesquisa de Chlamydia trachomatis Treponema pallidum Legionella sp Influenzavirus A Influenzavirus B e demais vírus respiratórios entre outros patógenos determinação de subgrupos de linfócitos presença de depósitos proteicos específicos na doença autoimune lúpus Já na técnica para detecção de anticorpos na imunofluorescência indireta IFI serão utilizados anticorpos antiimunoglobulina conjugados nomeados de anticorpo secundário É necessário que uma lâmina com os antígenos fixados previamente seja incubada com a amostra biológica que é o soro contendo uma mistura de anticorpos porém apenas o anticorpo específico vai se ligar aos antígenos da lâmina Após a incubação será adicionado o anticorpo secundário conjugado que se ligará na porção Fc do anticorpo específico que se ligou ao antígeno presente na lâmina O conjugado estará ligado à porção Fc na antiimunoglobulina permitindo a ligação pela porção Fab Para garantir que não haverá ligações inespecíficas entre anticorpos da amostra e o antígeno da lâmina entre cada etapa do procedimento é necessário realizar lavagens com soluções próprias Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Etapa 4 Antígeno Anticorpo Conjugado A B Figura 75 Imunofluorescência Indireta A amostra não possui anticorpos específicos contra o antígeno da lâmina é negativa A a amostra possui anticorpos específicos contra os antígenos da lâmina é positiva B Fonte TESTES sd e Schwanke et al 2014 152 Unidade III A detecção do anticorpo específico é possível pois quando ele está presente na amostra irá se ligar ao antígeno que foi previamente fixado em uma lâmina para que a ligação antígenoanticorpo seja visualizada adiciona um anticorpo antiimunoglobulina conjugado com um fluoróforo depois a imagem será visualizada no microscópio de fluorescência Ensaios imunoenzimáticos Elisa e western blotting O principal imunoensaio heterogênico é o Elisa enzyme linked immunosorbent assay que foi desenvolvido nos anos de 1970 e se popularizou comercialmente nos anos de 1985 com o ensaio para detecção de anticorpos antiHIV Esses ensaios possuem diversas apresentações porém têm como base a imobilização de um antígeno ou um anticorpo em uma fase sólida e a utilização de um conjugado que também poderá ser antígeno ou anticorpo ligado a uma enzima com atividade catalítica preservada A formação de um produto colorido pode ser observada visivelmente ou por meio de espectrometria pela medida de absorbância A observação visual permite determinar resultados qualitativos ou semiquantitativos se houver titulação da amostra já a leitura da absorbância permite a quantificação do analito Foi um método criado em alternativa ao radioimunoensaio O Elisa apesar de não detectar concentrações em pictogramas possui alta sensibilidade e especificidade é de rápida execução baixo custo e altamente adaptável a diferentes graus de automação Contudo é sempre necessário observar a padronização as condições de execução da técnica em cada etapa do teste deve ser considerada a concentração ideal de cada reagente as concentrações iônica e proteica o pH que podem interferir na eficiência do teste O western blotting vem sendo empregado desde 1980 mas recentemente foi incluída a técnica no diagnóstico e passou a ser vendido comercialmente É utilizado para caracterizar antígenos além de distinguir perfis de especificidades dos anticorpos É um método qualitativo Para a realização da técnica inicialmente deverá ser realizada uma eletroforese que vai separar uma mistura complexa de proteínas a amostra terá suas proteínas solubilizadas desnaturadas e as pontes dissulfetos reduzidas aplicadas em um gel de poliacrilamida no qual estará submerso em um tampão O sistema vai ser submetido a uma corrente elétrica que vai separar as proteínas pelo peso molecular Para a desnaturação das proteínas e neutralização das cargas das cadeias laterais dos aminoácidos pode ser utilizado um detergente o dodecil sulfato de sódio Quando ele é utilizado a corrida eletroforética é nomeada de SDSPAGE Após a eletroforese a amostra é transferida para uma membrana e ficará imobilizada pode ser uma membrana de nitrocelulose ou acetato O resultado na membrana será revelado com o uso de um anticorpo primário que é específico para o antígeno uma proteína que estava presente na amostra que já está imobilizada na membrana porém essa ligação será visualizada sem a presença de um revelador Será necessário adicionar um anticorpo secundário uma antiimunoglobulina conjugado com uma enzima ou um radioativo ou um fluoróforo Dependendo do conjugado o método de revelação vai mudar podendo ser o uso de substrato cromogênico ou de equipamentos que revelem a radiação ou ainda que detectem a fluorescência 153 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA A metodologia de western blotting é usada na aplicação clínica principalmente no diagnóstico do HIV Além de ser um dos métodos confirmatórios de escolha ela pode ser utilizada para determinar o sorotipo do vírus diferenciando em HIV1 e HIV2 Já em pesquisa científica essa metodologia é utilizada sempre que se deseja confirmar a presença de uma proteína em uma amostra podendo ter diversas aplicações Como foi visto anteriormente ela pode ser utilizada na produção de anticorpos monoclonais e também em clonagem de proteínas estudos de expressão gênica entre outros Posteriormente essas técnicas serão utilizadas no diagnóstico de doenças virais congênitas e autoimunes assim como em imunohematologia com a aplicação em banco de sangue Lembrando que as aplicações se estendem para diversas outras patologias e são os métodos utilizados nas sorologias Além disso podem ser utilizados com diferentes propósitos na pesquisa Porém antes de as aplicações na clínica serem descritas será necessário entender como esses métodos são avaliados de acordo com a sua confiabilidade ou seja capacidade de acertar um resultado e quanto a sua reprodutibilidade Observação A técnica de Elisa desde sua padronização e difusão sobretudo com o início da pandemia de HIV já apresentou grandes e profundas modificações Sabese que hoje falamos de técnica de Elisa de quarta e até de quinta geração sempre buscando um maior grau de sensibilidade e especificidade Infelizmente o custo continua elevado e por vezes requer de equipamentos nem sempre acessíveis a todo tipo de laboratório Saiba mais Quando nos dirigirmos à testagem para SarsCoV2 covid19 é de suma importância identificar o tipo de teste ao qual estamos nos referindo Os testes possuem aplicações diferentes e os resultados podem sofrer interferências de acordo com a metodologia de cada teste As opções de testes são os testes de RTPCR aqueles que pesquisam o vírus no nariz e orofaringe e os testes sorológicos aqueles que pesquisam anticorpos contra o vírus no sangue Para saber mais sobre as vantagens e desvantagens de cada um e a importância no diagnóstico da infecção pelo SarsCoV2 leia PROTOSIQUEIRA R As diferenças entre os testes disponíveis para covid19 Laboratório Antonello maio 2020 Disponível em httpsbitly3waIex2 Acesso em 1º jul 2021 154 Unidade III Resumo Nesta unidade aprendemos mais sobre a importância clínica dos vírus pudemos comprender por exemplo que a grande maioria das infecções virais são subclínicas e podem ser por vezes superestimadas Entendemos que o diagnóstico de uma infecção requer muito conhecimento e habilidade além do dominio de técnicas clássicas em virología bem como interface com as áreas de biologia molecular e imunologia Reconhecemos as principais infecções virais que atingem a seres humanos e vimos um pouco sobre o impacto da pandemia de SarsCoV2 na população mundial Entendemos que o tratamento de infecções virais requer muito conhecimento sobre a clínica do paciente A melhor forma de se prevenir contra uma infecção viral é por meio da vacinação Sobre esse tema abordamos os diferentes tipos de vacinas suas vantagens e desvantagens Exercícios Questão 1 Leia o texto a seguir A pandemia de covid19 tem nas vacinas a esperança mais promissora e ansiosamente esperada Uma vacina eficaz será crucial para controlar a pandemia que já acometeu cerca de trinta e um milhões de indivíduos em todo o mundo e matou um milhão de pessoas A garantia de imunidade nos permitirá menor preocupação com o distanciamento social e todas as suas grandes implicações socioeconômicas A sequência genética do vírus divulgada precocemente em 11 de janeiro de 2020 desencadeou intensa atividade global de pesquisa para desenvolver uma vacina contra a doença A escala do impacto humanitário e econômico da pandemia de covid19 impulsionou a utilização de novas plataformas de tecnologia de vacina para acelerar as pesquisas e a primeira candidata a uma vacina entrou em testes clínicos em humanos em meados de março de 2020 numa rapidez sem precedentes LIMA E J D F ALMEIDA A M KFOURI R D Á Vacinas para a covid 19 o estado da arte Revista Brasileira de Saúde Materno Infantil 21 1319 2021 Disponível em httpsbitly3w5m8w0 Acesso em 19 jun 2021 Com base nas informações apresentadas e nos seus conhecimentos avalie as afirmativas e a relação proposta entre elas 155 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA I Tecnologias tradicionais de produção de vacinas como as que envolvem vírus vivos atenuados e inativados vêm sendo utilizadas em diversos ensaios clínicos porque II Preocupações com a biossegurança de vacinas de vírus atenuados têm dificultado os estudos com essa plataforma e por isso estudos com formas inativadas dos vírus costumam ser produzidos mais facilmente Assinale a alternativa correta A As afirmativas I e II são proposições verdadeiras e a II justifica a I B As afirmativas I e II são proposições verdadeiras e a II não justifica a I C A afirmativa I é uma proposição verdadeira e a II é uma proposição falsa D A afirmativa I é uma proposição falsa e a II é uma proposição verdadeira E As afirmativas I e II são proposições falsas Resposta correta alternativa B Análise das afirmativas I Afirmativa verdadeira Justificativa vacinas servem para proteger o indivíduo de uma doença ou para tornar os sinais clínicos da doença mais leves Os antígenos vacinais imitam uma infecção natural ao ativarem linfócitos T eou B Em novo contato com o antígeno as células de memória conseguem identificálo rapidamente e agem com grande eficiência impedindo a multiplicação do patógeno e evitando os sinais clínicos Existem basicamente dois tipos de vacinas convencionais as vacinas de vírus atenuados e as vacinas de vírus inativados As primeiras são compostas por microrganismos vivos modificados enquanto as segundas são compostas por patógenos inteiros mortos ou por parte deles O tipo de vacina influencia diretamente o grau de eficácia da vacinação Vacinas de vírus inativados estimulam com menor intensidade o sistema imune quando comparadas às vacinas de vírus atenuados Na figura a seguir temos um esquema relativo às vacinas de vírus inativado 156 Unidade III Figura 76 Disponível em httpsglobo3yjXklz Acesso em 28 jun 2021 157 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Vale destacar que Atualmente o desenvolvimento das vacinas concentrase em 4 diferentes tecnologias indicadas a seguir Vacinas de vírus inativados ou mortos ou atenuados enfraquecidos referese a métodos tradicionais que utilizam o próprio vírus para estimular o corpo a produzir a resposta imunológica Vacinas de vetor viral utilizam outro vírus que é geneticamente modificado para produzir proteínas virais no corpo e provocar uma resposta imunológica sem causar a doença Vacinas baseadas em proteínas utilizam uma proteína do vírus ou uma parte dela ou ainda proteínas que imitam algo da estrutura do vírus como seu revestimento externo para assim provocar uma resposta imunológica no corpo Vacinas de RNA e DNA são vacinas que possuem RNA ou DNA geneticamente modificado do vírus para gerar uma proteína Esta ao entrar em contato com o organismo é capaz de produzir resposta imunológica de forma segura Disponível em httpsbitly3haeP1E Acesso em 28 jun 2021 II Afirmativa verdadeira Justificativa de fato a utilização de formas atenuadas do vírus demanda maior atenção do ponto de vista da biossegurança Os processos clássicos de atenuação são realizados em cultura celular por múltiplas passagens em diferentes tipos celulares ovos embrionados ou animais de laboratório ou por alteração da expressão genômica pela deleção de genes específicos responsáveis pela virulência Vacinas atenuadas geralmente conferem longa imunidade pois nesse caso a vacinação mimetiza a infecção natural No entanto se houver alguma falha na atenuação do vírus a vacina poderá causar efeitos adversos Há componentes que podem causar reações adversas indesejáveis locais ou sistêmicas que variam de leves a severas de acordo com os componentes vacinais ou de acordo com a sensibilidade do animal ou da pessoa vacinada Devese considerar ainda que a preocupação com a biossegurança não impede que esse tipo de vacina seja usado em diversos estudos clínicos Questão 2 Leia o texto a seguir O surto ocasionado pelo SarsCoV2 responsável pela doença denominada covid19 foi relatado pela primeira vez em dezembro de 2019 em Wuhan na China e atualmente é considerado um problema de saúde pública global Devido à rápida disseminação da doença e ao grande número de casos confirmados e de óbitos ocorridos em diversos países os governantes tiveram que desenvolver medidas para conter a pandemia Até o momento o teste considerado padrãoouro para o diagnóstico final da covid19 é a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa RTPCR Estudos destacam que esse teste é utilizado para verificar a presença de mRNAs prémRNAs ou outros tipos de RNA como os RNAs não codificadores SOUZA OLIVEIRA E MATOS M F MORAIS A C L N Perspectiva de resultados falsonegativos no teste de RTPCR quando realizado tardiamente para o diagnóstico de covid19 InterAmerican Journal of Medicine and Health 3 17 2020 Disponível em httpsbitly3hacfZF Acesso em 21 jun 2021 158 Unidade III Sobre a técnica de PCR mencionada no texto anterior avalie as afirmativas I A reação em cadeia da polimerase PCR polimerase chain reaction é uma técnica de biologia molecular revolucionária que se baseia na síntese enzimática de cópias de ácidos nucleicos II Pela técnica do PCR uma região específica do genoma pode ser amplificada e multiplicada em milhões de cópias III Os seguintes componentes são necessários para a realização da PCR DNA genômico total DNA polimerase termoestável primers solução tampão cloreto de magnésio e nucleotídeos para a síntese das novas fitas de DNA IV Cada ciclo da PCR apresenta três fases fundamentais desnaturação anelamento e extensão Assinale a alternativa correta A Apenas a afirmativa I é correta B Apenas a afirmativa II é correta C Apenas as afirmativas II e III são corretas D Todas as afirmativas são corretas E Nenhuma afirmativa é correta Resposta correta alternativa D Análise das afirmativas I Afirmativa correta Justificativa a reação em cadeia da polimerase PCR realiza a amplificação e a multiplicação de segmentos de DNA por ciclos repetidos de replicação de DNA in vitro É um método eficaz moderno e muito utilizado para a amplificação de segmentos específicos de DNA II Afirmativa correta Justificativa sucessivas rodadas ou ciclos de desnaturação e de síntese de DNA usando os mesmos iniciadores geram milhares de cópias do trecho desejado É importante notar que apenas a sequência entre os iniciadores é realmente amplificada Esses ciclos adicionais repetidos de desnaturação e de síntese de DNA amplificam a região específica de maneira geométrica isto é 2 4 8 16 32 64 e assim por diante fazendo com que um fragmento de DNA em pequena quantidade seja amplificado a uma quantidade relativamente grande de DNA duplafita sendo que após 20 a 30 ciclos de PCR uma sequência de DNA pode ser pronta e facilmente identificada em um gel de agarose 159 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA III Afirmativa correta Justificativa esses componentes são indispensáveis para a realização da técnica A PCR usa a enzima DNApolimerase responsável pela síntese de DNA a partir de substratos de desoxinucleotídeos e de um molde de DNA de fita simples Essa enzima acrescenta nucleotídeos à extremidade 3 de um oligonucleotídeo customizado quando ele está anelado a um molde de DNA maior Isso gera uma região estendida de DNA duplafita IV Afirmativa correta Justificativa para que o ciclo completo aconteça os passos a seguir devem acontecer Dois oligonucleotídeos sintéticos de fita simples são sintetizados Um deles tem a sequência complementar à extremidade 5 de uma das fitas do DNA a ser amplificado e o outro é complementar à extremidade 5 da outra fita O DNA a ser amplificado é desnaturado com o uso da temperatura e os oligonucleotídeos são anelados às suas sequênciasalvo Com isso a enzima DNApolimerase e os substratos de desoxinucleotídeos são acrescentados à reação e a enzima estende os dois iniciadores Essa reação produz DNA de duplafita sobre a região de interesse em ambas as fitas de DNA Assim nesse ciclo da PCR são produzidas cópias de duplafita dos fragmentos iniciais de DNA 160 REFERÊNCIAS AGUDO I et al Aplasia medular transitória associada a infecção por Parvovírus B19 Rev Soc Bras Clin Med v 14 n 3 julset 2016 Disponível em httpsbitly36kYcuh Acesso em 1º jul 2021 ALMEIDA L M M et al Resposta in vitro de fungos agentes de micoses cutâneas frente aos antifúngicos sistêmicos mais utilizados na dermatologia An Bras 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