Microbiologia e Micologia Clínica

Autor Prof Flávio Buratti Gonçalves Colaborador Prof Luiz Henrique Cruz de Mello Microbiologia e Micologia Clínica Professor conteudista Flávio Buratti Gonçalves Biomédico graduado pela Universidade de Mogi das Cruzes 1996 especialista em Diagnóstico Laboratorial de Doenças Tropicais pela FMUSP especialista em Acupuntura Tradicional Chinesa mestre em Saúde Pública pela Faculdade de Saúde Pública da USP 2000 Doutor em Patologia Ambiental e Experimental pela UNIP 2017 Habilitações nas áreas de Análises Clínicas Microbiologia Imunologia Parasitologia Saúde Pública e Acupuntura Atualmente é coordenador do curso de Biomedicina na modalidade semipresencial e docente da UNIP nas áreas de Microbiologia Imunologia Parasitologia Bioquímica Linhas de pesquisa Patologia Ambiental e Experimental Neuroimunopatologia Microbiologia e Imunologia É membro do Banco de Avaliadores Basis do Inep Todos os direitos reservados Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma eou quaisquer meios eletrônico incluindo fotocópia e gravação ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem permissão escrita da Universidade Paulista Dados Internacionais de Catalogação na Publicação CIP G635m Gonçalves Flavio Buratti Microbiologia e Micologia Clínica Flavio Buratti Gonçalves São Paulo Editora Sol 2021 168 p il Nota este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e Pesquisas da UNIP Série Didática ISSN 15179230 1 Identificação 2 Cultura 3 Técnica I Título CDU 5768 U51265 21 Prof Dr João Carlos Di Genio Reitor Prof Fábio Romeu de Carvalho ViceReitor de Planejamento Administração e Finanças Profa Melânia Dalla Torre ViceReitora de Unidades Universitárias Profa Dra Marília AnconaLopez ViceReitora de PósGraduação e Pesquisa Profa Dra Marília AnconaLopez ViceReitora de Graduação Unip Interativa EaD Profa Elisabete Brihy Prof Marcello Vannini Prof Dr Luiz Felipe Scabar Prof Ivan Daliberto Frugoli Material Didático EaD Comissão editorial Dra Angélica L Carlini UNIP Dr Ivan Dias da Motta CESUMAR Dra Kátia Mosorov Alonso UFMT Apoio Profa Cláudia Regina Baptista EaD Profa Deise Alcantara Carreiro Comissão de Qualificação e Avaliação de Cursos Projeto gráfico Prof Alexandre Ponzetto Revisão Bruno Barros Vera Saad Sumário Microbiologia e Micologia Clínica APRESENTAÇÃO 7 INTRODUÇÃO 7 Unidade I 1 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA CLÍNICA 9 11 Considerações gerais sobre a microbiologia no laboratório de análises clínicas principais equipamentos e níveis de biossegurança 9 12 Principais métodos de coloração meios de cultura e técnicas de semeadura aplicados na prática da microbiologia 18 13 Automação no laboratório de microbiologia clínica 28 14 Introdução à coleta de material biológico para prática em microbiologia clínica 31 15 Resistência bacteriana aos antimicrobianos e microrganismos multirresistentes condutas do laboratório de microbiologia clínica em infecções hospitalares35 2 IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAMPOSITIVOS NEISSERIAS E BACTÉRIAS ANAERÓBIAS 41 21 Identificação presuntiva dos estafilococos 41 22 Identificação presuntiva dos estreptococos 44 23 Identificação presuntiva de Neisserias 48 24 Identificação presuntiva de bactérias anaeróbias50 3 IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS BACILOS GRAMNEGATIVOS NÃO FERMENTADORES E BACILOS CURVOS ESPIRALADOS 55 31 Identificação presuntiva de enterobactérias 55 32 Identificação presuntiva de bacilos Gramnegativos não fermentadores 62 33 Identificação presuntiva de bacilos curvos espiralados 65 4 PROTOCOLOS ESPECIAIS NO DIAGNÓSTICO EM BACTERIOLOGIA CLÍNICA 67 41 Urocultura 67 411 Tipos de amostra 68 412 Procedimento 69 413 Laminocultivo sistema comercial 72 42 Coprocultura 73 421 Procedimento 75 43 Hemocultura77 431 Procedimento 79 44 Culturas de secreções e feridas 82 441 Cultura de secreção prostática vaginal cervical e uretral 82 442 Cultura de secreções de oro e nasofaringe 85 443 Cultura de escarro 86 444 Cultura de aspirado traqueal lavado bronco alveolar BAL e escovado brônquico 87 445 Cultura de secreção ocular e de ouvido 88 45 Cultura de ponta de catéter 89 46 Culturas de liquor e de líquidos especiais 91 461 Processamento da amostra e análise dos resultados da cultura de LCR 92 462 Coleta processamento e análise da cultura de fluidos biológicos 93 Unidade II 5 MICOLOGIA CLÍNICA 99 51 Importância clinica dos fungos e aspectos fisiopatológicos gerais99 52 Características gerais das micoses 103 521 Micoses superficiais e cutâneas 103 522 Micoses subcutâneas 105 523 Micoses sistêmicas 105 524 Micoses oportunistas 107 53 Aspectos gerais do diagnóstico micológico 110 6 TÉCNICAS E PROTOCOLOS PARA ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS LEVEDURIFORMES E FILAMENTOSOS 115 61 Identificação de fungos leveduriformes 115 62 Identificação de fungos filamentosos 118 63 Métodos moleculares e alternativos para identificação de fungos patogênicos 119 Unidade III 7 VIROLOGIA CLÍNICA 125 71 Principais doenças virais de importância clínica 125 72 Prevenção de doenças virais vacinas e drogas antivirais 134 8 DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS 137 81 Técnicas clássicas em virologia 138 82 Técnicas moleculares em virologia 141 83 Técnicas imunosorológicas aplicadas em virologia 144 7 APRESENTAÇÃO Objetivase com este livrotexto apresentar os principais tópicos que norteiam a microbiologia clínica por meio do estudo da bacteriologia micologia e virologia O livrotexto apresenta as principais doenças de etiologia bacteriana fúngica e viral as principais formas de prevenção tratamento e diagnóstico São apresentados também os principais equipamentos utilizados em laboratório de microbiologia clínica e automação em microbiologia clínica São vistos os conceitos básicos de biossegurança e conceitos importantes de infecção hospitalar e de como elas podem ser classificadas e identificadas Discutese ainda a problemática da resistência microbiana aos antibióticos antifúngicos e antivirais Objetivase também abordar de forma minuciosa os principais protocolos e métodos utilizados em microbiologia clínica para o diagnóstico das doenças de etiologia infecciosa como urocultura coprocultura hemocultura cultura de secreções entre outras Serão abordados exemplos de infecções e de como proceder para a identificação do agente causal associado a partir de fluxogramas e sequências didáticas que irão favorecer uma conduta assertiva e eficaz Também serão vistas mais a fundo as principais técnicas utilizadas no diagnóstico micológico e virológico nesse caso incluindo técnicas clássicas e as mais atuais relacionadas ao diagnóstico imunológico e de biologia molecular INTRODUÇÃO Neste livrotexto estudaremos os principais tópicos relacionados ao estudo da bacteriologia micologia e virologia clínica reconhecendo as formas como ocorre o desenvolvimento das principais doenças de origens bacterianas fúngicas e virais suas formas de prevenção tratamento e de diagnóstico Este livrotexto destinase a servir como instrumento da aprendizagem para os estudantes da área da saúde por meio de uma visão ampla da microbiologia clínica buscando ser atrativo e didático Os conteúdos selecionados buscam atender de forma objetiva clara e concisa os conceitos mais relevantes da patologia geral patologia específica e da anatomia patológica Com esse aprendizado o estudante adquire as habilidades e competências necessárias à formação do biomédico estando apto a reconhecer as alterações do estado de saúde reconhecer e interpretar a evolução das doenças e elaborar um plano preventivo além de propostas terapêuticas e de diagnóstico Bons estudos 8 9 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Unidade I 1 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA CLÍNICA 11 Considerações gerais sobre a microbiologia no laboratório de análises clínicas principais equipamentos e níveis de biossegurança O laboratório é um espaço físico com parâmetros ambientais controlados equipado com diversos instrumentos de medição que permitem a correta medida ou análise das grandezas físicas Nele realizamse os procedimentos experimentais cálculos medições análises químicas físicas ou biológicas e demais funções que exijam controle e precisão alcançáveis apenas em ambiente planejado para tal O objetivo do laboratório de microbiologia não é apenas apontar o responsável por um determinado estado infeccioso mas sim indicar através do monitoramento de populações microbianas qual o perfil dos microrganismos que estão interagindo com o homem Com essas informações a equipe de saúde é capaz de definir quais microrganismos podem ser responsáveis pelo quadro clínico do paciente e assim propor um tratamento mais adequado No entanto para alcançar esses objetivos os laboratórios de microbiologia devem possuir estrutura capaz de estabelecer informações sobre a melhor amostra biológica reconhecer a microbiota normal e os contaminantes identificar microrganismos cujo tratamento beneficia o paciente identificar microrganismos com propósitos epidemiológicos obter resultados rápidos em casos de emergência racionalizar no uso de antimicrobianos realizar o transporte rápido das amostras e o relato dos resultados e manter uma educação médica contínua em relação aos aspectos da infecção hospitalar Entre os equipamentos e vidrarias mais utilizados na prática da microbiologia clínica destacamse Autoclave é o equipamento responsável pela esterilização a partir do calor úmido em que através do vapor promove a desnaturação de proteínas dos microrganismos O equipamento consiste em uma câmara de vapor com a temperatura de ebulição em torno de 121 C A autoclave é um equipamento indispensável ao laboratório de microbiologia na esterilização de meios de cultura água suspensões entre outros O tempo de autoclavagem deve ser respeitado de acordo com o material a ser esterilizado O equipamento deve ser aberto com cautela quando a pressão chegar a zero pois o vapor liberado é de alta temperatura Recomendase a utilização de luvas de amianto para abrir a autoclave Estufas de esterilização fornos de Pasteur esse equipamento é utilizado para esterilização a seco a temperatura de 170200 C por 12 horas recomendado o uso para as vidrarias Refrigerador após o preparo de meio de culturas para garantir a conservação dos microrganismos recomendase deixálos sob baixa temperatura 10 Unidade I Figura 1 Autoclave Disponível em httpsbitly3y36m6a Acesso em 28 jun 2021 Estufa bacteriológica auxilia no crescimento dos microrganismos devido à incubação ser em temperatura ideal Mesa agitadora rumbeira auxilia no crescimento de microrganismos aeróbios pois a mesa agitadora através dos movimentos rotatórios dissolve o oxigênio do meio de cultura Capela de fluxo laminar câmara asséptica dotada de exaustor e lâmpada fluorescente utilizada na repicagem de microrganismos Fermentador equipamento no qual ocorrem as fermentações podendo ser dotado de sistemas de agitação aeração e refrigeração Placa de Petri utilizado para o isolamento de fungos e bactérias pois a placa de petri tem uma superfície de crescimento grande e possibilita o crescimento de diversos microrganismos na mesma placa Figura 2 Placa de Petri Fonte Oliveira 2018 11 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Alça de Drigalsky é utilizada para espalhar microrganismos em meio de cultura sólido Figura 3 Alça de Drigalski Cabo de Kolle é utilizado como suporte para o fio de platina ou liga de níquelcromo esse material cabo de Kolle fio de platina é usado para a inoculação de microrganismos Importante salientar que antes de qualquer procedimento no laboratório a bancada deve ser limpa com solução detergente seguida de uma solução com álcool a 70 Vale ainda lembrar que cada material ou equipamento possui uma forma correta de ser tratado a fim de garantir sua desinfecção e padrão de limpeza mínimos para a realização eficiente dos processos microbiológicos Observação Toda vidraria utilizada no laboratório de microbiologia antes de ser preparada para esterilização deverá estar limpa e seca O material deve ser acondicionado também de forma adequada e cada material dispõe de uma forma correta para tal a fim de garantir a qualidade dos procedimentos que serão realizados Não obstante os equipamentos utilizados quando no laboratório de microbiologia clínica devese atentar a todas as normas de biossegurança Quando se lida com microrganismos potencialmente patogênicos e de alto risco para desenvolvimento de doença classificamos os níveis de biossegurança em quatro designados como NB1 NB2 NB3 e NB4 em que NB é a sigla reconhecida para nível de biossegurança Os laboratórios classificados como nível de biossegurança NB1 são projetados para trabalhos com agentes biológicos de classe de risco 1 São locais apropriados para o treinamento educacional ou para o treinamento de técnicos e de professores de técnicas laboratoriais A principal contenção em um laboratório NB1 é o conjunto de boas práticas de laboratório o que inclui a especificação adequada do uso de EPI como aventais de mangas compridas e luvas descartáveis não sendo fundamental a existência de fluxo laminar 12 Unidade I No manual de boas práticas deve constar a especificação dos desinfetantes e produtos de limpeza com a respectiva concentração As salas devem ser separadas da área de passagem de pessoas por portas simples e os revestimentos devem ser feitos com materiais que facilitem a limpeza Esses revestimentos devem ser laváveis e não podem ser porosos O esgoto do laboratório pode ser descartado na rede pública Devem existir pias para limpeza das mãos lavaolhos e um chuveiro de emergência As bancadas não podem ter emendas na superfície e devem ser resistentes ao ataque de produtos químicos Deve existir um local para armazenamento de produtos de uso imediato e o espaço entre as bancadas deve permitir a circulação de pessoas O laboratório deve ter acesso a uma autoclave para a esterilização de vidrarias e instrumentos e possuir um local específico para a colocação de objetos pessoais e de aventais Deve ser colocado o símbolo de risco biológico na porta do laboratório O nível de biossegurança 2 é semelhante ao primeiro e é adequado ao trabalho que envolva agentes de risco moderado para as pessoas e o meio ambiente Difere do NB1 nos seguintes aspectos o pessoal de laboratório deverá ter um treinamento específico no manejo de agentes patogênicos e deve ser supervisionado por cientistas competentes o acesso ao laboratório deve ser limitado durante os procedimentos operacionais precauções extremas serão tomadas em relação a objetos cortantes infectados e determinados procedimentos nos quais exista a possibilidade de formação de aerossóis e borrifos infecciosos devem ser conduzidos em cabines de segurança biológica ou em outros equipamentos de contenção física O nível de biossegurança 3 é aplicável para laboratórios clínicos de diagnóstico ensino e pesquisa ou de produção em que o trabalho com agentes exóticos possa causar doenças sérias ou potencialmente fatais como resultado de exposição por inalação A equipe laboratorial deve possuir treinamento específico no manejo de agentes patogênicos e potencialmente letais devendo ser supervisionada por competentes cientistas que possuam vasta experiência com os agentes Todos os procedimentos que envolverem a manipulação de materiais infecciosos devem ser conduzidos dentro de cabines de segurança biológica ou de outro dispositivo de contenção física Os manipuladores devem usar roupas e equipamentos de proteção individual Sabese porém que algumas instalações existentes podem não possuir todas as características recomendadas para um nível de biossegurança 3 por exemplo uma área de acesso com duas portas selamento das entradas de ar Nessas circunstâncias um nível aceitável de segurança para a condução dos procedimentos de rotina por exemplo procedimentos para diagnósticos envolvendo a reprodução de um agente para identificação tipagem teste de susceptibilidade etc poderá ser conseguido com instalações do nível de biossegurança 2 garantindose que o ar liberado do laboratório seja jogado para fora da sala a ventilação do laboratório seja equilibrada para proporcionar um fluxo de ar direcionado para dentro da sala o acesso ao laboratório seja restrito quando o trabalho estiver sendo realizado e as práticas padrão de microbiologia as práticas especiais e o equipamento de segurança necessários para o nível de biossegurança 3 sejam rigorosamente cumpridos A decisão de implementar essas modificações das recomendações do nível de biossegurança 3 deve ser tomada somente pelo diretor do laboratório 13 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA O nível de biossegurança 4 é indicado para o trabalho que envolve agentes exóticos e perigosos que exponham o indivíduo a um alto risco de contaminação de infecções que podem ser fatais além de apresentarem um potencial elevado de transmissão por aerossóis Os agentes com uma relação antigênica próxima ou idêntica à dos agentes incluídos no nível de biossegurança 4 deverão ser manipulados nesse nível até que se consigam dados suficientes para confirmação do trabalho seja para esse nível ou nível inferior A equipe do laboratório deverá ter um treinamento específico e completo direcionado para a manipulação de agentes infecciosos extremamente perigosos e deverá ser capaz de entender as funções da contenção primária e secundária das práticas padrão específicas do equipamento de contenção e das características do planejamento do laboratório Os trabalhadores deverão ser supervisionados por cientistas competentes treinados e com vasta experiência no manuseio dos agentes O acesso ao laboratório deverá ser rigorosamente controlado pelo diretor A instalação deverá ser em um edifício separado ou em uma área controlada dentro do edifício que seja totalmente isolada de todas as outras Um manual de operações específico para as instalações deverá ser preparado ou adotado Dentro do ambiente de trabalho todas as atividades deverão permanecer restritas às cabines de segurança biológica classes III ou II usadas com roupas de proteção com pressão positiva e ventiladas por sistema de suporte de vida O laboratório do nível de biossegurança 4 deverá possuir características específicas quanto ao projeto e à engenharia para prevenção da disseminação de microrganismos no meio ambiente O quadro a seguir apresenta de forma resumida os padrões e práticas especiais bem como os equipamentos de segurança e as instalações que deverão ser aplicados aos agentes designados aos níveis de biossegurança 1 2 3 e 4 respectivamente Quadro 1 Níveis de biossegurança recomendados para agentes infecciosos NB Agentes Práticas Equipamentos de segurança barreiras primárias Instalações barreiras secundárias 1 Que não são conhecidos por causarem doenças em adultos sadios Práticas padrão de microbiologia Não são necessários Bancadas abertas com pias próximas 2 Associados com doenças humanas risco de lesão percutânea ingestão exposição da membrana e mucos Prática de NB1 e acesso limitado avisos de risco biológico precauções com objetos perfurocortantes manual de biossegurança que defina qualquer descontaminação de dejetos ou normas de vigilância médica Barreiras primárias cabines de classe I ou II ou outros dispositivos de contenção física usados para todas as manipulações de agentes que provoquem aerossóis ou vazamento de materiais infecciosos procedimentos especiais como o uso de aventais luvas e proteção para o rosto quando necessário NB1 mais autoclave disponível 14 Unidade I NB Agentes Práticas Equipamentos de segurança barreiras primárias Instalações barreiras secundárias 3 Agentes exóticos com potencial para transmissão via aerossol a doença pode trazer consequências sérias ou até fatais Práticas de NB2 e acesso controlado descontaminação de todo o lixo descontaminação da roupa usada no laboratório antes de ser lavada amostra sorológica Barreiras primárias cabines de classe I ou II ou outros dispositivos de contenção usados para todas as manipulações abertas de agentes uso de aventais luvas e proteção respiratória quando necessário NB2 mais separação física dos corredores de acesso portas de acesso dupla com fechamento automático ar de exaustão não recirculante fluxo de ar negativo dentro do laboratório 4 Agentes exóticos ou perigosos de alto risco de doenças que ameaçam a vida infecções laboratoriais transmitidas via aerossol ou relacionadas a agentes com risco desconhecido de transmissão Prática de NB3 e mudança de roupa antes de entrar banho de ducha na saída todo o material descontaminado na saída das instalações Barreiras primárias todos os procedimentos conduzidos em cabines de classe III I ou II juntamente com macacão de pressão positiva com suprimento de ar NB3 mais edifício separado ou área isolada sistemas de abastecimento e escape a vácuo e de descontaminação outros requisitos sublinhados no texto Adaptado de Ministério da Saúde 2006 Entendemos portanto que a biossegurança se resume ao conjunto de medidas e ações importantes e que devem necessariamente ser implementadas para a segurança do profissional e para a qualidade dos ensaios que são realizados Além do que apresentamos sobre quatro níveis de biossegurança fazse importante relembrar conceitos básicos os quais também podem ser encontrados de forma resumida no quadro anterior Quanto à vestimenta é necessário utilizar roupas adequadas ao trabalho laboratorial dessa forma o profissional deve usar sempre calça comprida visto que bermuda shorts ou saias são incompatíveis com o ambiente devese usar camisa ou camiseta não sendo permitido o uso de camisetas regatas Os sapatos devem ser fechados não sendo permitido o uso de chinelos e sandálias Devese usar jaleco de algodão preferencialmente de mangas compridas até a altura dos pulsos O seu uso é restrito apenas ao laboratório Ao sair do laboratório devese tirar o jaleco e deixálo em local apropriado Quanto aos hábitos de higiene pessoal em relação aos cabelos eles devem ser mantidos sempre presos e em alguns casos a depender do tipo de procedimento o uso de touca é essencial O uso de cosméticos é incompatível com o trabalho realizado no laboratório Não se deve portanto utilizar maquiagem Devese ainda evitar o uso de unhas postiças Manter as unhas naturais curtas e sem esmaltes Não usar adornos como anéis pulseiras relógios entre outros Ao sair do laboratório é necessário sempre lavar as mãos pois durante todo o trabalho desenvolvido no ambiente laboratorial serão manuseados diversos materiais biológicos os quais podem conter microrganismos com diferente potencial de virulência eou patogenicidade sem contar substâncias que podem trazer agravos de ordem química ou física A limpeza das mãos tem como objetivo garantir que o profissional não leve consigo resíduo de reagentes ou agentes patogênicos os quais podem causar irritação por contato em parte específicos do corpo como olhos nariz orelha e boca ou ainda infectar o indivíduo sendo causa de doença 15 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA A D G B E H C F I Figura 4 Passo a passo da lavagem de mãos 1 passo palmas A 2 passo dorso B 3 passo entre os dedos C 4 passo polegares D 5 passo articulação E 6 passo ponta dos dedos unhas F 7 passo punhos G 8º passo enxaguar as mãos iniciando pelos dedos e seguindo para os punhos H 9º passo secar as mãos e os punhos com papel toalha descartável I A lavagem das mãos como demostrado no esquema anterior é um processo que deve ser realizado pragmaticamente a fim de garantir a segurança do profissional de laboratório Para tal alguns cuidados devem ser observados como retirar todos os acessórios como anéis pulseiras e relógio fechar a torneira com papel toalha caso ela possua contato manual para fechamento e para prevenir que a pele resseque é necessário evitar lavar as mãos com água muito quente ou muito fria Lembrete Lavar as mãos já foi comprovadamente considerada uma das formas mais eficazes de evitar a propagação de doenças infecciosas A seguir seguem algumas normas as quais constituem importante fator para a segurança individual e coletiva de quem trabalha em laboratório de análises clínicas Sendo recomendado que todos os profissionais a sigam no desempenho de suas atividades laborais são elas I É necessário trabalhar com método atenção e calma II O uso do avental no laboratório é obrigatório de preferência confeccionado com algodão e de manga comprida 16 Unidade I III Acidentes de qualquer natureza devem ser comunicados ao instrutor IV Durante a permanência no laboratório devese evitar passar os dedos na boca nos olhos ou no nariz Ao sair devese lavar as mãos V Se algum ácido ou qualquer outro produto químico for derramado o local deve ser lavado imediatamente com bastante água VI Antes de utilizar um reagente devese ler com atenção o rótulo do frasco O frasco de reagente sempre deve ser segurado com o rótulo voltado para a palma da mão VII Antes de realizar uma experiência de laboratório devese ler com atenção o procedimento operacional padrão POP do método a ser realizado VIII Quando necessário devem ser utilizados equipamentos de proteção individual EPIs IX Quando for realizado trabalho com reagentes que liberem vapor gases venenosos ou irritantes a capela deve ser utilizada X Não se deve fumar e comer no laboratório XI Devemse jogar todos os sólidos e pedaços de papel usado em coletores especificados XII Devese manter limpo o local de trabalho Além dos cuidados abordados em muitos procedimentos em microbiologia clínica fazse necessária a utilização dos EPIs sendo preciso observar em cada atividade a ser realizada a necessidade específica de cada item e de seu uso Esses equipamentos devem ser utilizados em situações que oferecem riscos sobretudo aos olhos e sistema respiratório Os EPIs são de uso obrigatório e exigidos quando a atividade a ser desenvolvida oferecer riscos As empresas costumam disponibilizar EPIs como sapatos luvas óculos protetor auricular e avental para que dessa forma os colaboradores exerçam suas atividades com a máxima tranquilidade e segurança A seguir são mostrados tipos de EPIs utilizados em laboratório de microbiologia clínica Máscara óculos e visor esses equipamentos são considerados individuais de proteção EPIs que devem ser utilizados em situações que oferecem riscos aos olhos e sistema respiratório Os óculos de segurança são utilizados para a proteção dos olhos Os óculos escuros são indicados para proteção contra radiação UVA e UVB 17 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Figura 5 Óculos de segurança comum e de sol Máscara para poeira esse equipamento é muito utilizado contra poeiras e particulados ou em situações para proteção de respingos da fala Não indicado contra poeiras toxicas gases etc Figura 6 Máscaras para poeira Máscara N95 esse equipamento é utilizado durante a manipulação de amostras de isolamento respiratório PBK Visor protetor facial ou face shield esse equipamento protege a face contra respingos provenientes de reações químicas ou provenientes da fala Figura 7 Visor protetor facial Jaleco ou avental o uso desse item é obrigatório dentro do laboratório pois protege a parte superior do corpo contra possíveis derramamentos de soluções reagentes etc O jaleco deve permanecer no laboratório após sua utilização Deve ser usado preferencialmente jaleco feito de algodão impermeável 18 Unidade I Luvas de segurança esse equipamento protege as mãos durante o manuseio de soluções devese ter cautela no uso quando próximo da chama do bico de Bunsen ou de qualquer outro material inflamável ou que produza chama Os tipos mais comuns são de PVC látex e luva nitrílica Alguns cuidados são necessários para que o uso das luvas de segurança se torne correto e adequado Saiba mais Os ambientes de trabalho em especial na área da saúde oferecem riscos para seus trabalhadores uma vez que frequentemente os expõem a condições que possam resultar em acidentes e processos patológicos quando medidas de proteção individual e coletiva não são adotadas Para conhecer mais sobre o uso correto de EPI e o quanto o uso é priorizado por profissionais da saúde leia LIMA R Agentes biológicos e equipamentos de proteção individual e coletiva conhecimento e utilização entre profissionais Revista Prevenção de Infecção e Saúde v 3 n 3 2017 Disponível em httpsbitly3x04bAd Acesso em 29 jun 2021 12 Principais métodos de coloração meios de cultura e técnicas de semeadura aplicados na prática da microbiologia Os microrganismos e as estruturas celulares geralmente são transparentes no entanto com o emprego de um microscópio óptico e técnicas de coloração ou exame a fresco é possível visualizar essas estruturas Confecção de lâminas a fresco em que o material é colocado entre lâminas e lamínulas com uma gota de solução fisiológica ou solução de KOH a 10 é muito utilizada visto que permite a visualização de estruturas celulares e microrganismos principalmente para pesquisa de fungos O emprego de corantes é muito comum e eficaz na microscopia em microbiologia Corantes como tinta da China são utilizados principalmente em amostras de liquor cefalorraquidiano para a pesquisa de Cryptococcus neoformans Azul de metileno pode ser utilizado em algumas pesquisas como identificação de grânulos metacromáticos de Corynebacterium diphtheriae O uso de corantes para a microscopia também pode ser utilizado em técnicas de colorações diferencias as mais utilizadas são a técnica de coloração de Gram e a técnica de coloração de Ziehl Neelsen que veremos detalhadamente a seguir A técnica de Gram como pode ser observada na figura a seguir permite uma visualização aprimorada das estruturas de bactérias fungos leucócitos e outros elementos Permite obter informações essenciais para o início do tratamento A visualização de amostras após a coloração de Gram proporciona adquirir informações úteis sobre os processos infecciosos visto que as informações da cultura são demoradas Essas informações em conjunto com o conhecimento de quais microrganismos geralmente infectam 19 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA certos sítios possibilitam indicar a antiobioticoterapia inicial até os resultados da cultura e teste de sensibilidade ficarem prontos Em alguns casos os microrganismos não apresentam nenhum crescimento nos meios geralmente utilizados na microbiologia ficando a cargo da bacterioscopia o diagnóstico final I Cobrir a lâmina pingando gotas de cristal de violeta e aguardar um minuto Em seguida desprezar o corante lavar a lâmina com um filete de água II Cobrir a lâmina com lugol aguardar um minuto e desprezar o corante Lavar a lâmina com um filete de água III Aplicar álcool etílico ou cetona para descorar a lâmina por 30 segundos e em seguida lavar a lâmina em água corrente IV Cobrir a lâmina com fucsina e deixar agir por 30 segundos e em seguida lavar a lâmina em um filete de água V Secar a lâmina com auxílio de um papel limpo ou deixála secar ao ar livre VI Para visualização do microrganismo deve ser aplicada uma gota de óleo de imersão sobre a lâmina e em seguida observála no microscópio com objetiva de 100 X Aplicação de cristal violeta corante púrpura 1 3 2 4 Aplicação de iodo mordente Lavagem com álcool descoloração Aplicação de safranina contracorante Grampositiva Gramnegativa Cocos grampositivos Basotonete gramnegativo Álcool Safranina Iodo Cristal violeta Legenda B A LM 5 µm Figura 8 Representação esquemática da técnica de coloração de Gram Procedimento técnico da coloração de Gram A Análise ao microscópio da técnica resultando em bactérias coradas em azul Grampositivas e em rosa Gramnegativas B Fonte Tortora Funke e Case 2017 p 65 O resultado da técnica consiste em visualizar esquematizar e descrever a morfologia classificando as bactérias existentes nas lâminas de acordo com a reação diante dos corantes utilizados na técnica de Gram As bactérias Grampositivas têm a parede celular composta por mureína e após a descoloração com o álcool etílico a bactéria mantém a coloração do corante primário roxo Já as bactérias Gramnegativas com parede celular composta por ácidos graxos são incapazes de reter o cristal de violeta assumindo assim a cor do corante de fundo vermelho 20 Unidade I A B Figura 9 Exemplos de bactérias Gram Grampositivas Staphylococcus spp A e de Gramnegativa Escherichia coli B O princípio da coloração de ZiehlNeelsen se fundamenta no fato de que a parede celular sobretudo de micobactérias é formada por vários lipídeos e ácidos micólicos e não apresenta peptidoglicano Nesse caso a conjugação de diversos desses lipídeos com a fucsina gera agrupamentos que são responsáveis pelo caráter tintorial de preservação à descoloração por soluções álcoolácidas Esse grupo de bactérias é denominado como bacilos álcoolácido resistentes Baar Diversas amostras podem ser coradas pela técnica de ZiehlNeelsen Entre elas estão as biópsias de fragmentos líquidos cavitários urina secreções purulentas e principalmente escarro Os cuidados para o preparo do material a ser corado são extremamente importantes considerando o grau de virulência dos agentes associados A seguir de forma resumida os principais cuidados no preparo do material biológico a ser corado I O preparo do esfregaço deve ocorrer de preferência na capela de segurança biológica e obrigatoriamente utilizando EPI avental máscara N95 luvas e óculos de proteção Caso não tenha capela de segurança biológica a lâmina deve ser preparada próxima ao bico de Bunsen II Identificar a lâmina com nome do paciente e números de identificação III Utilizar sempre lâminas novas e limpas com álcool IV Abrir o recipiente minuciosamente impedindo a produção de aerossóis V Utilizando um palito de madeira separar a fração mais purulenta do material VI Colocar a fração separada na lâmina de vidro Com palito estender o material até a extremidade oposta da lâmina Deslocar o palito de uma extremidade a outra até conseguir um esfregaço homogêneo que ocupe 23 da lâmina VII Desprezar o palito em recipiente plástico firme que deverá ser descontaminado na autoclave VIII Posicionar a lâmina para cima e aguardar secagem em temperatura ambiente IX Após a secagem passar a lâmina rapidamente por 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen X Colocar a lâmina no suporte e aguardar que esfrie 21 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Tomados os devidos cuidados o procedimento da coloração de ZiehlNeelsen segue como descrito a seguir I Cobrir todo o esfregaço da lâmina com corante fucsina de Ziehl filtrada II Percorrer chama lentamente por baixo das lâminas até que comece a exalar vapores Remover a chama rapidamente para impedir que a fucsina ferva III Cronometrar 5 minutos assim que começar a surgir o vapor e repetir o processo por mais 2 vezes nesse período de 5 minutos IV Enxaguar as lâminas cuidadosamente com água corrente retirando todo corante V Cobrir toda a lâmina com álcoolácido e aguardar 1 minuto VI Enxaguar as lâminas com água corrente VII Observar se as lâminas ficaram descoradas se estiver levemente rosada refazer o item V VIII Cobrir as lâminas com azul de metileno filtrado IX Esperar 30 segundos X Lavar a lâmina retirando o azul de metileno Esperar secar e estará pronta para leitura ao microscópio Na interpretação da lâmina de escarro é necessário observar 100 campos úteis de microscópio ou seja campos em que sejam encontradas células provenientes do pulmão Para baciloscopia de outras amostras clínicas após concentração ou não o esfregaço deve ser oval e é necessário ser observada toda a região com material Seguindo alguns critérios podemos quantificar o grau de positividade da lâmina analisada Quadro 2 Critérios para leitura e interpretação dos resultados da baciloscopia de escarro Resultado Observação Negativas Não foram encontrados Baar em cem campos observados Quantificado 1 a 9 Baar em cem campos observados Positivo Presença de 10 a 99 Baar em 100 campos observados Positivo Média de 1 a 10 Baar por campo nos primeiros 50 campos observados Positivo Média de mais de 10 Baar por campo nos primeiros 20 campos observados 22 Unidade I Saiba mais Apesar de ser uma doença antiga com diagnóstico clínicolaboratorial simples e de tratamento barato gratuito no nosso país e eficaz a tuberculose pulmonar ainda é um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo Para saber mais sobre o diagnóstico em especial a coloração de ZiehlNeelsen leia COSTA R R SILVA M R GONÇALVES I C Diagnóstico laboratorial da tuberculose revisão de literatura Revista Médica de Minas Gerais v 28 n 5 2018 Disponível em httpsbitly3llpJnM Acesso em 2 ago 2021 Além das técnicas de coloração apresentadas na prática da microbiologia clínica temos que estar constantemente atentos com os meios de cultura que serão utilizados para a execução de cada protocolo pois disso depende a qualidade e assertividade do resultado a ser fornecido Nesse sentido devemos relembrar algumas informações acerca do tema Meio de cultura é o material nutritivo preparado para o desenvolvimento de microrganismos Algumas bactérias podem crescer normalmente em qualquer tipo de meio outras bactérias exigem meio de cultura específico Existem também aquelas que não se desenvolvem em nenhum tipo de meio de cultura já desenvolvido O tipo de meio utilizado para os microrganismos se desenvolverem depende de vários fatores origem do material a ser analisado espécie que deseja obter na amostra necessidades nutricionais dos organismos A especificidade dos meios de cultura é muito importante nomeadamente no isolamento e identificação de certos microrganismos como isolamento de microrganismos do solo ou na análise microbiológica de águas alimentos entre outros Para o desenvolvimento de microrganismos em laboratório há uma grande variedade de meios de cultura Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico sólidos quando há ágar na concentração de 1 a 20 semissólidos quando a quantidade de ágar eou gelatina é de até 05 líquidos sem agentes solidificantes apresentandose como um caldo A consistência do meio de cultura é influenciada pela presença do ágar que consiste de um polissacarídeo complexo obtido a partir de algas marinhas que vem sendo bastante utilizado na 23 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA microbiologia Os meios podem ser classificados quanto a sua composição simples ou quimicamente definidos básicos ou complexos também podem ser classificados quanto a seu estado físico líquidos semissólidos e sólidos e também em função de sua aplicação seletivos diferenciais de préenriquecimento ou de enriquecimento Meios quimicamente definidos sua composição química exata é conhecida Esses meios são utilizados sobretudo em pesquisa a fim de avaliar comportamentos nutricionais e processos metabólicos de microrganismos específicos Meios de cultura básicos permitem o crescimento bacteriano sem satisfazer nenhuma exigência em especial Meios de cultura complexos são compostos de nutrientes como extratos de levedura carne plantas ou produtos proteicos de outras fontes Tais extratos fornecem as vitaminas e os outros fatores de crescimento orgânico como os extratos de levedura que são extremamente ricos em vitaminas B Meios líquidos os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa Meios semissólidos além de possuir nutrientes em sua composição apresentam ágar em pequena quantidade Meios sólidos possuem em sua composição nutriente e ágar Meios seletivos elaborados com o objetivo de favorecer o crescimento de outras bactérias O ágar sulfeto de bismuto por exemplo é um dos meios de cultura utilizados para isolamento de bactéria causadora do tifo a bactéria gramnegativa Salmonella typhi a partir das fezes Exemplo de meios eletivo meio ágar Sabouraud é um meio que contém nutrientes que favorecem o crescimento de diversos fungos O meio diferencial utilizado para fácil identificação de bactéria de interesse específico pois geralmente outras bactérias crescem na mesma placa de meio de cultura Em alguns casos as características dos meios seletivos e diferenciais podem estar combinadas no mesmo meio de cultivo Podese obter um meio diferencial por exemplo incorporandose a um meio básico 5 de sangue de carneiro Dessa forma tornase um meio de cultura complexo e ao mesmo tempo diferencial pois dessa forma podese observar três tipos de hemólise uma observação fundamental por exemplo para a caracterização de bactérias tanto do gênero estreptococos como estafilococos A título de informação adicional os três tipos de hemólise conhecidas são Alfahemólise ocorre lise parcial das hemácias É possível visualizar uma área de coloração esverdeada ao redor das colônias bacterianas Betahemólise ocorre lise total das hemácias Formará áreas claras em torno das colônias bacterianas 24 Unidade I Gamahemólise não ocorre lise das hemácias Meios de préenriquecimento utilizado para recuperar os microrganismos danificados por algum tipo de tratamento térmico ou químico água peptonada e caldo lactosado Meio de enriquecimento utilizado para separar bactérias presentes em pequenas quantidades de outras presentes em grandes quantidades Geralmente esse meio é utilizado em amostras de fezes e solos Exemplo caldo tetrationato e selenitocistina para cultivo de salmonelas líquidos e caldo tioglicolato para Clostridium perfringens A diversidade dos meios de cultura é essencial para processo de identificação dos microrganismos Compreender o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adaptar ao perfil bacteriano contribui muito no processo de diagnóstico microbiológico O quadro a seguir apresenta alguns dos principais meios de cultura utilizados no laboratório de microbiologia clínica e sua finalidade Quadro 3 Principais meios de cultura e sua finalidade na prática clínica Meio de cultura Finalidade Ágar chocolate Isolamento de Haemophilus sppNeisseria spp Branhamella catarrhalis e Moraxella spp em amostras clínicas Ágar MacConkey É um meio seletivo pela presença de sais biliares cristal de violeta e NaCl para isolamento de bacilos Gramnegativos enterobactérias e não fermentadores Ágar MuellerHünton Utilizado para realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelo método de difusão em disco KirbyBauer para bactérias de crescimento rápido Ágar sangue Meio utilizado para a maioria dos materiais clínicos permite o crescimento de grande parte dos patógenos não fastidiosos ou que requerem incubação especial Verificação de hemólise dos Streptococcus spp e Staphylococcus spp Caldo tioglicolato Meio liquido enriquecedor Agar cystine lactose electrolyte deficient Cled Usado para isolamento identificação de microrganismos presentes em amostra de urina A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus spp Ágar SalmonellaShigella SS Meio para isolamento de Salmonella sp e Shigella sp Permite diferenciar bactérias lactose positivas e negativas além de detectar a produção de H2S Ágar dnase Verificar se bactéria possui a enzima desoxiribonuclease a qual degrada DNA Ágar citrato de simmons Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono Auxilia na identificação das enterobactérias Ágar chromoagar Identificar e isolamento da maioria das espécies de Candida spp Ágar Sabouraud AS Verificar o crescimento de espécies de Candida e fungos filamentosos Observação Apesar de existirem muitos meios vendidos prontos comercialmente a habilidade de preparar um meio de cultura e saber reconhecer qual o melhor meio para a obtenção do melhor isolamento bacteriano é função básica e primordial de todo profissional da área de análises clínicas 25 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Vale salientar nesse momento os principais cuidados no preparo e armazenamento dos meios de cultura ponto crítico para a qualidade do resultado da amostra biológica avaliada No preparo de um meio básico confeccionado in house de forma caseira como chamamos e a título de exemplificação inicialmente devemos ligar o pHmetro meia hora antes do uso e após esse período calibrálo com soluções padrões Em seguida devese definir a quantidade de meio a ser preparado e pesar a quantidade necessária de ágar e sacarose Colocar 40 do volume de água destilada em recipiente apropriado ao volume final a ser preparado Pipetar as soluções dissolver a sacarose e completar com água a metade do volume final Ajustar o pH sendo o valor final em torno de 58 Em outro recipiente devese colocar ágar e a outra metade da água e em seguida dissolver no microondas em potência alta ou sobre a chama do bico de Bunsen agitando de vez em quando O meio estará pronto quando estiver transparente começando a ferver Devese misturar as partes e distribuílas nos tubos de ensaio ou placa petri tampar os tubos com papel alumínio ou tampa plástica e levar para a autoclave por cerca de 20 minutos Após o preparo dos meios eles devem ser colocados em recipientes tubos de ensaio ou placa petri Devem ficar sobre a bancada até atingir a temperatura ambiente e devem ser armazenados em geladeira por no máximo sete dias Saiba mais Meios de cultura são essenciais para qualquer procedimento em microbiologia clínica sobretudo em bacteriologia e micologia e saber reconhecer sua composição especificidade e aplicações é tarefa importante a todo profissional de laboratório Portanto para saber mais sobre meios de cultura faça a leitura do manual da Anvisa ANVISA Descrição dos meios de cultura empregados nos exames microbiológicos sl sd Disponível em httpsbitly2UKOkal Acesso em 29 jun 2021 Após compreendermos sobre os principais métodos de coloração e meios de cultura é importante salientar a importância das diferentes técnicas de semeadura de material biológico as quais servem para qualificar e quantificar o crescimento microbiano A utilização dessas técnicas além de importante para evitar a contaminação dos meios de cultura no momento de executálas estabelece um padrão necessário para a execução de cada protocolo Para tanto devese tomar inicialmente alguns cuidados 26 Unidade I Flambar a alça níquel cromo ou o fio de platina antes e depois de qualquer técnica de semeadura Flambar a boca dos tubos de ensaio quando a técnica for realizada neles Semeaduras realizadas em placa de Petri deverão ser próximas ao bico de Bunsen para evitar contaminação com o ar Para a semeadura adequada dos diferentes tipos de material biológico em razão dos diferentes protocolos a serem realizados são utilizadas metodologias distintas a saber Técnica de esgotamento a metodologia de semeadura por esgotamento pode ser aplicada para o crescimento de colônias isoladas avaliar a capacidade de crescimento ou não no meio de cultura isolamento de organismos presentes em grandes números relativos à população microbiana Para realizar a técnica de esgotamento é necessário semear o microrganismo com a alça níquel suavemente sobre o meio de cultura fazendo um ziguezague em sentido único em toda a extensão da placa de Petri Assim que finalizar a técnica a placa deve ser guardada em temperatura adequada e permanecer por tempo suficiente até o desenvolvimento de colônias Figura 10 Técnica de esgotamento na placa de Petri Técnica em estrias a metodologia de semeadura por estrias pode ser aplicada para estocar material estudar o metabolismo dos organismos na bioquímica e avaliar a capacidade de crescimento ou não no meio de cultura Para realizar a técnica de estrias é necessário semear o microrganismo com a alça de níquel fazendo estrias na superfície de um meio de cultura sólido Figura 11 Técnica em estrias na placa de Petri 27 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Técnica quantitativa a metodologia de semeadura quantitativa é recomendada para a semeadura de líquidos com o objetivo de obter o crescimento de colônias isoladas a quantidade de colônias e avaliar a capacidade de crescimento ou não no meio de cultura Para realizar a técnica quantitativa é necessário coletar com alça calibrada um material clínico Devese realizar com a alça o estriamento de uma ponta outra em linha reta por toda a superfície do ágar Em seguida devese fazer uma linha perpendicular à estria inicial Figura 12 Técnica quantitativa na placa de Petri Técnica em picada a metodologia de semeadura em picada é recomendada para a semeadura em tubos de ensaio e tem como objetivo verificar a agilidade do microrganismo no ágar Para realizar a técnica em picada é necessário semear o microrganismo com auxílio de uma agulha de níquel cromo fazendo uma picada no centro do meio de cultura no tubo de ensaio e penetrar agulha até a metade do tubo Verificar os resultados após o período de incubação Figura 13 Técnica de picada em tubo As diferentes formas de se semear o material clínico fazem parte de processos estabelecidos em procedimentos operacionais padrões a fim de garantir a qualidade e reprodutibilidade dos testes e ensaios realizados Após o preparo do meio de cultura e semeadura do material biológico partese para o processo de identificação do patógeno o qual se inicia com a observação a olho nu com lupa ou microscópio das colônias isoladas No estudo das colônias deve ser observada a forma do microrganismo bem como seu 28 Unidade I tamanho superfície estrutura e pigmentação As principais características observadas no líquido são o tipo de crescimento na superfície a opacidade ou turvação cheiro sedimento e pigmentação Após o crescimento das colônias isoladas no meio de cultura podemos identificar suas características Essas peculiaridades são de grande valia para selecionar as provas bioquímicas necessárias para completar o processo de identificação Puntiforme Forma Elevação Margem Plana Inteira Elevada Ondulada Convexa Lobulada Crateriforme Filamentosa Papilada Espiral Circular Filamentosa Irregular Rizoide Fusiforme Figura 14 Morfologia das colônias Fonte Câmara 2013 13 Automação no laboratório de microbiologia clínica Em 1881 Robert Koch relatou sua primeira descoberta a respeito da bacteriologia descrevendo gelatinas como fontes de nutrientes para bactérias Após tantas décadas as placas de Petri contendo meios de cultura com nutrientes continuam sendo a base para os laboratórios de microbiologia A rotina nos exames de microbiologia clínica é baseada no cultivo e isolamento de colônias puras dos microrganismos identificação fenotípica e testes de sensibilidade aos antimicrobianos utilizados para o tratamento mas é notório que a microbiologia vem avançando de maneira importante o que tem conduzindo a migração para a automação também para esse setor a exemplo do que ocorre em outros setores do laboratório clínico O fluxo de trabalho na microbiologia vem aumentado significativamente desafiando os microbiologistas a escolherem a automação mais adequada com baixo custo e alta especificidade Outro fator relevante a ser considerado é o surgimento de novos mecanismos de resistência e a necessidade de investigações epidemiológicas decorrentes do aumento do número de microrganismos multirresistentes o que é sem dúvidas um dos maiores desafios na rotina dos serviços da microbiologia O setor de microbiologia clínica é historicamente considerado lowtech ou seja baixo grau de automação ou tecnologia associada quando comparado ao elevado grau de automação encontrado no laboratório de forma geral como no setor de bioquímica clínica 29 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA De maneira geral as automações disponíveis para o laboratório de microbiologia clínica permitem a identificação de diversos microrganismos em um período entre 1624 horas de incubação O teste de sensibilidade aos antimicrobianos TSA pode ser realizado concomitantemente à identificação e liberado no mesmo prazo O TSA quando automatizado é liberado como sensível intermediário ou resistente seguido da concentração inibitória mínima CIM ou MIC de cada fármaco testado Os principais mecanismos de resistência bacteriana de interesse clínico como a produção de betalactamases de espectro estendido ESBL por bactérias Gramnegativas ou a resistência à meticilina ou à vancomicina em bactérias Grampositivas são detectados e reportados por laudo microbiológico gerado nessas plataformas Desde o lançamento da automação AutoMicrobic System projetado no final dos anos 1960 pela McDonnell Douglas a pedido da Nasa uma infinidade de produtos tem surgido no mercado mundial Os principais equipamentos atualmente disponíveis nesse campo são o sistema automatizado Phoenix lançado pela Becton Dickinson em 2003 o sistema MicroScan WalkAway fabricado por Dade Behring INC EUA o sistema Vitek introduzido pela bioMérieux em 1997 e o sistema MaldiTOFMS Matrix Associated Laser DesorptionIonization Time of Flight Mass Spectrometry que se baseia na técnica de espectrometria de massa MS para identificar microrganismos Estudos comparativos entre essas metodologias têm sido descritos na literatura mundial Em laboratórios de análises clínicas quando há alta demanda de amostras que serão submetidas ao setor de microbiologia essas tecnologias podem ser aplicadas principalmente para diagnóstico de infecções hospitalares ou como metodologia padrão em laboratórios de referência uma vez que a necessidade da automação se faz indispensável para dar suporte à procura apesar de o custo inicial ser alto A automação se mostra consideravelmente vantajosa nesse setor das análises clínicas proporcionando uma maior agilidade na obtenção dos resultados finais e melhor precisão na identificação de diversas espécies de microrganismos os quais são aspectos importantes na rotina do laboratório clínico e microbiológico minimizando o tempo para a realização de diagnósticos convencionais e otimizando por exemplo a terapia antimicrobiana É importante salientar que os métodos automatizados contribuem muito para a otimização de um exame microbiológico embora não seja possível às vezes mensurar seu impacto clínico por conta da dificuldade de realização desses estudos clínicolaboratoriais De qualquer forma vale ressaltar que ao acelerarmos os resultados microbiológicos como isolamento e identificação dos principais microrganismos epidemiologicamente relevantes estamos proporcionando ao médico assistente as escolhas mais apropriadas de antibioticoterapia Assim os pacientes podem reagir mais rápido e ter alta em menos tempo minimizando sua permanência no hospital e assim diminuindo a emergência de infecções hospitalares especialmente por bactérias mais resistentes As automações no entanto também apresentam limitações e muitas vezes é necessário recorrer a testes offline para conseguir resultados confiáveis A liberação da CIM da polimixina por exemplo tem sido alvo de diversos debates nos últimos anos A padronização da liberação da polimixina B por microdiluição não automatizada in house limitou a realização do teste pelas plataformas atualmente disponíveis 30 Unidade I A identificação microbiológica de fungos e bactérias patogênicos tem sido realizada classicamente por métodos que envolvem cultura e depois testes fenotípicos explorando as diferenças metabólicas que existem entre as várias espécies Culturas são métodos extremamente poderosos de recuperação de patógenos teoricamente um único patógeno viável em meio adequado se multiplica em escala logarítmica amplificando assim o sinal a partir de amostras com pouquíssimos agentes Entretanto culturas demoram Dependendo do patógeno culturas podem ser positivas tão precocemente como quatro a seis horas ou tão demoradas como semanas e os testes fenotípicos podem demorar mais 24 ou 48 horas Em algumas circunstâncias como bacteremias a identificação e o tratamento adequado são aspectos críticos e mostram claramente que a cada hora de demora no tratamento adequado de uma septicemia a mortalidade aumenta de 10 a 20 O tempo de hospitalização e o preço de uma internação igualmente diminuem com a identificação precoce da etiologia de uma sepse Novos métodos diagnósticos que não dependam do crescimento da bactéria ou fungo e que inclusive sejam efetivos quando os patógenos não estão viáveis têm sido desenvolvidos Os que utilizam ácidos nucleicos já estão em uso clínico mas apesar de serem mais rápidos que culturas demandam tempo de técnico e pelo menos 6 a 8 horas de trabalho com profissional dedicado Um grande progresso é o uso de estudos proteômicos para diagnóstico rápido tão rápido como 5 a 15 minutos na etiologia de infecções MaldiTOF consiste num sistema no qual o material biológico uma colônia ou um concentrado de hemocultura é colocado em uma placa em que há a matriz polimérica Isso é irradiado com um laser que vaporiza a amostra e há ionização de várias moléculas que são aspiradas num tubo de vácuo e levadas a um detector conforme a molécula o tempo de chegada ao detector time of flight é diferente Isso é colocado em gráfico dando vários picos e para cada espécie bacteriana ou fúngica obtémse um gráfico específico Uma base de dados computadorizada interpreta e fornece o resultado tudo com muita rapidez Tratase portanto de uma aplicação da espectrometria de massa Essa técnica permite diagnósticos microbiológicos complexos como a especiação correta dos estafilococos coagulase negativos ou a sorologicamente lenta e sujeita a erros definição dos vários sorovariantes da Salmonella entérica O diagnóstico de fungos de importância médica e de micobactérias é possível À medida que o uso dessa técnica aumenta os bancos de dados ficam mais completos e a identificação melhor Os bancos de dados são proprietários o que é uma desvantagem quando comparados aos bancos de dados de ácidos nucleicos como o blast que são públicos e de uso livre mas sujeitos de depósitos errados e alterações Já os bancos de dados proteômicos por ora são mais cuidados O sistema WalkAway inclui software projetado para simplificar o fluxo de trabalho e minimizar a interação do tecnólogo enquanto hospeda diferentes ambientes regionais e institucionais por meio de recursos de personalização extensivos O sistema em resumo Processa painéis de identificação rápida e especialidade para redução de velocidade quando a velocidade é importante Fornece uma precisão de padrão ouro para a identificação de microrganismos e testes de susceptibilidade 31 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Permite o processamento simultâneo de painéis convencionais rápidos e especiais em uma única plataforma automatizada Fornece uma detecção de resistência emergente precisa para os agentes patogênicos mais difíceis incluindo ESBL Visa VRSA e MRSA O sistema AutoSCAN4 faz parte do Sistema de Microbiologia MicroScan simplificando a identificação e testes de susceptibilidade aos antibióticos IDAST enquanto padronizam os resultados ao processar painéis em segundos O sistema autoSCAN4 inclui projetado para simplificar o fluxo de trabalho ao mesmo tempo que possui diferentes ambientes regionais e institucionais por meio de recursos de personalização extensivos A operação é fácil de aprender e usar com treinamento mínimo Automação econômica para baixos volumes Processa painéis convencionais com concentrações inibitórias mínimas MICs diretas e não identificadas ID para ajudálo a entrar na resistência emergente Processa os painéis de ID especiais para uma reviravolta reduzida quando a velocidade importa Os diagnósticos remotos opcionais fornecem um nível adicional de capacidade de resposta do serviço Observação Apesar de os métodos automatizados estarem se difundindo de forma bastante importante em razão da demanda por resultados em menor prazo o conhecimento do profissional continuará sendo essencial até mesmo para a programação da automação bem como análise dos resultados por ela fornecidos 14 Introdução à coleta de material biológico para prática em microbiologia clínica Será abordado breve resumo sobre os principais aspectos inerentes à coleta de material biológico na prática da microbiologia clínica salientando que mais adiante aos descrever os principais protocolos adotados no diagnóstico iremos aprofundar a discussão sobre os critérios e qualidade da amostra para realização de cada procedimento de forma específica A coleta e o transporte das amostras representam um ponto crítico na microbiologia pois a qualidade desses serviços pode ou não alterar nos resultados Se a instituição não recebe a amostra de forma adequada a informação repassada em muitos casos pode confundir ou desviar do verdadeiro resultado 32 Unidade I Fatores que podem comprometer o exame microbiológico hipótese diagnóstica mal elaborada informações mal colhidas incompletas ou não devidamente interpretadas etc requisição inadequada da análise laboratorial coleta conservação e transporte inadequados falhas técnicas no processamento da análise demora na liberação de resultado má interpretação dos resultados As informações básicas que devem constar da requisição médica são identificação clara do paciente nome e sobrenome registro no hospital ou serviço data de nascimento evitar confusão com homônimos e informações importantes relacionadas à faixa etária sexo por exemplo a interpretação de bacteriúria pode ser diferente para a mulher clínica leito ou ambulatório espaço para identificação do exame número da análise microbiológica e seção do laboratório São informações relevantes para o diagnóstico do processo infeccioso Dados gerais sobre o paciente Hipótese diagnóstica Dados clínicos descrever objetivamente os achados clínicos mais significativos lesões cutâneas ou de mucosas local e características do sítio de infecção etc Dados epidemiológicos relevantes viagem ou excursão se vive em área endêmica de alguma doença infecciosa malária riquetsioses cólera etc doença ocupacional contato com animais por exemplo acidentes mordida trauma picada de carrapato enchentes etc envolvimento em surto de infecção hospitalar etc Dados laboratoriais que evidenciem o sítio do processo infeccioso RX tomografia urina rotina hemograma etc Provável origem do processo infeccioso comunitário ou hospitalar Se hospitalar relacionado a procedimento invasivo sonda vesical cateter traqueostomia diálise alimentação parenteral cirurgia Existência de infecção em outra topografia Qual Uso de antibióticos nos últimos 10 dias por que e quais 33 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Paciente com comprometimento imunológico ou com algum fator predisponente à infecção oportunista prematuridade transplante de órgãos uso de droga imunossupressora diabetes câncer aids leucemia anemia falciforme talassemia hemofilia esplenectomia cirrose etc Suspeita de doença oportunista Qual Paciente transferido ou de alta nos últimos 30 dias de outro hospital É colonizado ou infectado ou portador de bactérias multirresistentes Data do pedido médico nome legível do médico carimbo eou ramal de contato facilita a comunicação para situações emergenciais como isolamento de M tuberculosis isolamento de nova cepa multirresistente etc Data e hora da coleta e nome de quem colheu o material permite reavaliação de procedimentos e reciclagem por exemplo quando se detecta excesso de contaminação em uroculturas etc Comentários quando necessários sobre o procedimento de coleta Por exemplo acidentes ou dificuldades para obtenção do material condições do paciente quantidade etc No caso de suspeita de infecção urinária informar se o paciente é sintomático ou não O profissional responsável pela coleta será também responsável por identificar de forma legível e correta o material a ser encaminhado ao laboratório de microbiologia Na amostra devem estar identificados nome e registro do paciente leito ou ambulatório e especialidade material colhido data hora e quem realizou a coleta quem colhe o material deve ser devidamente treinado e periodicamente reciclado nessa atividade Devese lembrar que o envolvimento do médico com o laboratório de microbiologia pode com frequência ser muito útil para ambos propiciando melhor orientação técnica mais objetividade facilitando a interpretação de resultados etc A importância do relacionamento médico e laboratório devese ao fato de que a microbiologia envolve etapas interpretativas para muitos exames como aqueles que envolvem microbiota mucosas ou no caso de agentes específicos em que são fundamentais escolha de meios seletivos uso de meios enriquecedores uso de suplementos ampliação do tempo de cultivo variação na temperatura de incubação adição de novos testes etc A coleta de todo tipo de material biológico visando a sua análise deve ser realizada seguindo minimamente os critérios a seguir Evitar a contaminação com microrganismos ao redor da áreasítio de coleta 34 Unidade I Selecionar a área correta de onde se quer obter as amostras e utilizar a técnica apropriada Coletar o volume necessário para análise pois caso a quantidade seja insuficiente os resultados podem ser prejudicados Identificar a amostra com a data de coleta local quem coletou e a quantidade coletada Colocar a amostra em recipiente apropriado Evitar derramar a amostra com a finalidade de garantir um resultado seguro Imediatamente após a coleta as amostras devem ser colocadas ao abrigo de luz solar e acondicionadas normalmente em refrigeração A coleta de amostras biológicas inclui sangue fezes urina secreções entre outras Para a coleta de sangue é necessário realizar uma punção arterial capilar ou venosa em alguns casos é necessário estar em jejum Conforme o sítio anatômico e a amostra a ser coletada será preciso utilizar uma técnica e material específicos para cada procedimento O profissional deve estar ciente que diversos fatores podem afetar diretamente o resultado ou a eficácia do tratamento que será dado ao paciente e portanto é fundamental conhecer esses fatores por exemplo evitar a contaminação da amostra coletando material diretamente do sítio real da infecção Bactérias da microbiota normal humana podem ser coletadas equivocadamente gerando um resultado errôneo com consequente indicação incorreta de tratamento em alguns casos podendo acarretar danos ao paciente Quando possível o material deve ser coletado no momento ideal visto que em uma determinada fase do processo infeccioso existe aumento populacional microbiano O que pode aumentar as chances de detecção do microrganismo mas para que se encontre o momento ideal é necessário entender o desenvolvimento da doença O número de amostras contínuas pode maximizar o resultado Por exemplo amostras de escarro nas primeiras horas do dia por três dias consecutivos ampliam o número de casos positivos na pesquisa de tuberculose Devese colher de preferência as amostras antes do início da administração de antibióticos uma vez que a antibioticoterapia diminuirá o número de microrganismos provocando um resultado falso negativo Para particularidades no procedimento como na coleta da urina é necessário que haja assepsia do local antes da micção e que seja desprezado o primeiro jato para que não haja interferência nos resultados Para a coleta de secreções é necessário utilizar swab agulha ou outro tipo de coletor Esses pontos são essências para identificação correta dos microrganismos 35 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA A grande dificuldade na etapa de transporte é manter a condição natural da amostra Com esse propósito é necessário evitar que a amostra fique exposta ao frio eou ao calor excessivo Deve seguir as especificações para cada tipo de amostra por exemplo frasco com escarro não precisa de refrigeração se for brevemente processado Amostras de urina devem ser transportadas o quanto antes uma vez que há degradação e fácil contaminação Amostras devem ser bem embaladas para evitar o vazamento Deve ser utilizado o recipiente ideal para determinado tipo de amostra de acordo com o exame que será realizado Meios de transporte permitem manter a integridade da amostra por mais tempo os mais utilizados são Stuart Amies e CareyBlair Transportar as amostras imediatamente ao laboratório para assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo pois o laboratório de microbiologia trabalha basicamente em função da viabilidade dos microrganismos evitar o contato prolongado dos microrganismos com anestésicos utilizados durante a coleta pois eles poderão exercer atividade bactericida evitar erros de interpretação nas culturas quantitativas principalmente urina e lavado bronco alveolar 15 Resistência bacteriana aos antimicrobianos e microrganismos multirresistentes condutas do laboratório de microbiologia clínica em infecções hospitalares O conhecimento do fenômeno de resistência bacteriana data do início da era microbiana Com a introdução das primeiras substâncias químicas com finalidades terapêuticas observouse que determinadas populações bacterianas expostas a diferentes agentes sobreviviam a essa exposição As espécies bacterianas podem apresentar duas formas de resistência a natural ou intrínseca e a adquirida A resistência adquirida é sem dúvidas a forma mais preocupante Ela é descrita em praticamente todas as espécies de bactérias e já são conhecidos muitos dos mecanismos envolvidos nesses processos Sabese também que a capacidade de as bactérias serem resistentes a diferentes antibacterianos não é uma propriedade nova ou particular de determinada espécie Fatores como uso empírico de antibacterianos contribuem de forma considerável para o surgimento desses fenômenos de resistência As bactérias têm a capacidade de se comunicar entre indivíduos da mesma espécie e ou de espécies diferentes e por meio dessa interação procariota ocorre a transferência de elementos genéticos móveis capazes de modificar tanto a sua estrutura celular como levála a produzir substâncias capazes de neutralizar a ação dos antibacterianos Vários são os mecanismos de resistência desenvolvidos entre eles destacamse a capacidade de reduzir purinas impedindo a penetração do fármaco na célula bacteriana a superexpressão de bomba de efluxo promovendo a expulsão do fármaco da célula bacteriana a modificação de estruturas 36 Unidade I responsáveis pela formação da parede celular como as proteínas ligadoras de penicilina PBPs e a produção de enzimas capazes de promover a hidrólise dos fármacos como as betalactamases Existem quatro técnicas recomendadas para a avaliação do perfil de sensibilidade bacteriano são elas técnicas de microdiluição técnicas de macrodiluição etest difusão em ágar As técnicas de macrodiluição microdiluição e etest têm como princípio e objetivo determinar a concentração inibitória mínima CIM do fármaco capaz de destruir eou de impedir o crescimento bacteriano A técnica de discodifusão em ágar também conhecida como técnica de discodifusão de KirbyBauer fornece um resultado qualitativo do potencial antibacteriano por meio da ausência presença ou presença reduzida de um halo de inibição de crescimento No método de KirbyBauer com o auxílio de uma alça bacteriológica tocase a superfície de 4 a 5 colônias bacterianas de aspecto similar a fim de obtenção do inóculo Após a realização desse processo transferese esse inóculo para um tubo contendo 5 ml de solução salina estéril ajustando a turvação para 05 da escala McFarland que corresponde a uma quantidade de 108 UFCml Submergir a essa suspensão um swab também conhecido como ceconete eliminar todo o excesso de líquido pressionandoo contra a parede interna do tubo Em seguida realizase um semeio do tipo distensão na placa de ágar MullerHünton de modo a cobrir todo o espaço da superfície do ágar com a suspensão bacteriana Passado esse procedimento recolocar a tampa da placa e deixar em repouso por 5 minutos para a secagem do ágar antes da colocação dos discos de antibióticos A escolha do antibacteriano deverá obedecer às recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI Os discos de antibióticos devem ser colocados de forma manual sobre a superfície do meio com auxílio de pinça estéril respeitando um distanciamento de 20 mm um do outro Feito isso os discos devem ser pressionados à superfície do meio com a ponta da pinça Após essa etapa as placas devem ser incubadas em estufa bacteriológica em temperatura de 35 C por um período de 18 h Passado o período de incubação fazse a medição do diâmetro da zona de inibição do crescimento bacteriano ao redor de cada disco de antibiótico caso ela seja formada como pode ser observada a seguir 37 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Figura 15 Teste de discodifusão de Kirby Bauer indicando pela seta como é realizada a medição do halo Adaptada de Rodrigues 2014 A seguir uma relação de alguns antibacterianos recomendados para teste pela técnica de KirbyBauer para os organismos bacterianos mais frequentes no laboratório clínico de acordo com CLSI Enterobacteriaceae penicilinas penicilinas associadas a inibidores de betalactamases cefalosporinas carbapenêmicos monobactâmicos fluorquinolonas aminoglicosídeos glicopeptídeos macrolídeos tetraciclinas inibidores de folato fenicóis fosfonicinas e nitrofuranos Pseudomonas aeruginosa penicilinas penicilinas associadas a inibidores de betalactamase cefalosporinas carbapenêmicos monobactâmicos fluorquinolonas e aminoglicosídeos Acinetobacter sp penicilinas penicilinas associadas a inibidores de betalactamase cefalosporinas aminoglicosídeos fluorquinolonas inibidores de folato e tetraciclinas Staphylococcus sp fluorquinolonas aminoglicosídeos macrolídeos tetraciclinas nitrofurantoína lincosamidas cloranfenicol rifampicina linezolida e teicoplanina cefoxitina 30 µg Sabese que o principal mecanismo de resistência desenvolvido por bacilos Gramnegativos é a produção de betalactamases São espécies de bacilos Gramnegativos Enterobacteriaceae Acinetobacter sp e Pseudomonas aeruginosa Betalactamases de espectro estendido ESBL mecanismo presente sobretudo em espécies pertencentes à família das Enterobacteriaceae Essas betalactamases são caracterizadas por promoverem a hidrólise de cefalosporinas de terceira geração são sensíveis à cefoxitina hidrolisam o Aztreonam e por apresentarem um grupo serina como componente estrutural possuem sensibilidade aos inibidores de betalactamases Observase que a grande maioria das ESBLs hidrolisa também as cefalosporinas de quarta geração Sua confirmação pode ser observada com uso da técnica do discoaproximação Produção de AmpC A produção de betalactamases do tipo AmpC caracterizase por promover hidrólise das cefalosporinas de terceira geração e hidrolisar cefoxitina Apesar de sua pesquisa no laboratório clínico 38 Unidade I não ser tão frequente esse mecanismo inspira cuidados principalmente quando está associado a outros mecanismos sobretudo os de produção enzimática Existem dois tipos de produção AmpC a forma plasmidial podendo ser encontrada em todas as espécies de bacilos Gramnegativos e o cromossômico induzível frequente em espécies pertencentes ao grupo CESP Citrobacter sp Enterobacter sp Serratia sp e Providencia sp Carbapenemases As cepas produtoras de carbapenemases apresentam resistência a todos os betalactâmicos De acordo com sua diversidade bioquímica estrutural esse grupo subdividese em carbapenemases que apresentam um grupamento serina em seu sítio ativo e carbapenemases que apresentam um íon zinco em seu sítio ativo Dentro desse grupo destacamse as formas IMP imipenemases VIM verona metallo betalactamase NDM nova delhimetallo betalactamase OXA oxacilinase SPM São Paulo betalactamase e a KPC carbapenemase sendo esta a única que apresenta um grupo de aminoácido serina em seu sítio ativo Grupo KPC Esse grupo de carbapenemases apresenta uma sensibilidade in vitro aos inibidores de betalactamases Fenotipicamente a determinação desse grupo é feita pelo teste de Hodge modificado MHT o qual é realizado a partir do semeio em placa de ágar MuellerHünton por distensão de uma suspensão 05 McFarland de Escherichia coli ATCC25922 acompanhado de repique na forma de estria vertical de colônia suspeita para produção de KPC2 e um controle positivo Klebsiella pneumoniae CCBH4955 Após as etapas de semeio devese adicionar ao centro da placa um disco de ertapeném é o disco mais sensível para confirmação de produção de carbapenemase incubando em seguida a placa a uma temperatura de 35 C por um período de 18 h Definese como prova MHT positiva a formação de um trevo nas bordas da estria do inóculo suspeito como pode ser observado a seguir Figura 16 Ao fundo semeio de suspensão de cepa Escherichia coli ATCC25922 e estrias de Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC2 O crescimento da cepa de E coli em direção ao halo de inibição formado pela presença do disco de ertapeném ou meropenem indica que a cepa pesquisada produz carbapenemase Fonte UFRN sd 39 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Saiba mais A resistência bacteriana é problema frequente e importante no ambiente hospitalar Várias bactérias apresentam habilidade de desenvolver mecanismos de resistência enzimática nesse contexto destacase a K pneumoniae produtora de carbapenemase conhecida Para saber mais sobre a importância dessa bactéria no ambiente hospitalar leia DIENSTMANN R et al Avaliação fenotípica da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase KPC em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 fev 2010 Disponível em httpsbitly2Tk0eHR Acesso em 29 jun 2021 Grupo MBL Bactérias produtoras de metallobetalactamases que apresentam em sua unidade estrutural um íon Zn2 Apresentam um complexo perfil de resistência a todas as classes de betalactâmicos apresentando uma sensibilidade in vitro ao aztreonam Esse tipo de mecanismo de produção de carbapenemase muitas vezes está associado a outros diferentes mecanismos de resistência como os de modificação estrutural redução de porina e superexpressão de bomba de efluxo No laboratório clínico utilizase a prova de inativação iônica quelação por meio da utilização de uma solução padronizada de ácido etilenodiaminotetracético EDTA para a confirmação fenotípica desse mecanismo Prova do EDTA Preparase uma suspensão 05 McFarland da bactéria suspeita semeia em ágar MuellerHünton Em seguida acrescentase um disco de carbapenêmico ertapeném de um lado da placa paralelo a esse disco acrescentase outro disco de carbapenêmico ertapeném saturado com uma gota da solução de EDTA Após esse processo incubar a 35 C por 18 h Assim a formação de halo eou aumento de 5 mm no halo formado pela ação do disco saturado com EDTA caracterizase como prova positiva As infecções hospitalares constituem hoje um grave problema de saúde pública no país e muitos se perguntam se tais situações serão os sintomas mais evidentes da inadequação do sistema de saúde sinônimo de erro médico colocando a responsabilidade de sua ocorrência sobre o profissional de saúde ou na instituição prestadora de assistência Evidentemente o profissional de saúde ou o hospital não contamina voluntariamente seus pacientes mas a inobservância de princípios básicos do controle das infecções hospitalares pode ter consequências drásticas Assim é importante ter profissionais conscientes trabalhando em equipe respeitando cada um dentro de suas funções atualizandose com frequência e com capacidade de se autoavaliarem O controle das infecções hospitalares no Brasil teve seu marco referencial com a Portaria MS n 196 de 24 de junho de 1993 que instituiu a implantação de Comissões de Controle de Infecções Hospitalares em todos os hospitais do País independentemente de sua natureza jurídica 40 Unidade I A Lei n 943197 instituiu a obrigatoriedade da existência da Comissão de Controle de Infecção Hospitalar CCIH e de um Programa de Controle de Infecções Hospitalares PCIH definido como um conjunto de ações desenvolvidas deliberada e sistematicamente tendo como objetivo a redução máxima possível da incidência e gravidade das infecções nosocomiais Em 1998 o Ministério da Saúde editou a Portaria 261698 com diretrizes e normas para a execução dessas ações adequandoas à nova legislação A Portaria 261698 traz diretrizes e normas para o controle das infecções hospitalares Em seu anexo II traz conceitos e critérios para o diagnóstico das infecções classificandoas em comunitárias ou hospitalares A infecção é classificada como comunitária quando é constatada em incubação no ato de admissão do paciente desde que não relacionada com internação anterior no mesmo hospital A infecção é hospitalar em decorrência de qualquer infecção adquirida após a internação do paciente e que se manifesta durante a internação ou mesmo após a alta quando puder ser relacionada com a internação ou procedimentos hospitalares Fernandes 2000 no livro Infecção hospitalar e suas interfaces na área da saúde elaborou um fluxograma que facilita a distinção entre infecções hospitalares e comunitárias como pode ser observado a seguir Perinatal Comunitária Comunitária Hospitalar Hospitalar Hospitalar Hospitalar Hospitalar Comunitária Sim Infecção neonatal Transplacentária congênita Período que hospitalização Período incubação está descrito Procedimento invasivo associado Internação 72 24 horas Bolsa Comunitária Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Não Não Não Não Não Não Não Não Figura 17 Fluxograma para diferenciação de infecções hospitalares e infecções comunitárias Fonte Fernandes 2000 p 201 41 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA A prática da quimioprofilaxia para doenças infecciosas referese ao uso de uma droga por um paciente com risco aumentado para o desenvolvimento de infecção tendo por objetivo reduzir a incidência de doença e morte A quimioprofilaxia contra algumas bactérias é de grande importância em saúde pública Suas indicações devem sempre seguir as normas estabelecidas pelos serviços públicos de saúde Entre as infecções que requerem tratamento quimioprofilatico de prevenção destacamse Neisseria meningitidis Haemophilus influenzae tipo b Corynebacterium diphtheriae e Mycobacterium tuberculosis Saiba mais As infecções hospitalares enquanto ocorrência vinculada tanto às condições intrínsecas do pacientecliente quanto às açõesprocedimentos realizados pela equipe multiprofissional atuante nas instituições têm sido tema de discussões e reflexões por parte dos trabalhadores da área da saúde bem como da comunidade em geral e você pode saber mais sobre infecção hospitalar lendo AZAMBUJA E P PIRES D P VAZ M R C Prevenção e controle da infecção hospitalar as interfaces com o processo de formação do trabalhador Texto contexto enferm v 13 número especial 2004 Disponível em httpsbitly3AmhOvM Acesso em 29 jun 2021 2 IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAMPOSITIVOS NEISSERIAS E BACTÉRIAS ANAERÓBIAS 21 Identificação presuntiva dos estafilococos Os estafilococos são bactérias inquestionavelmente mais resistentes no meio ambiente Podem sobreviver por meses em amostras clínicas secas são relativamente resistentes ao calor e podem tolerar uma concentração aumentada de sal Indivíduos sadios são colonizados intermitentemente por Staphylococcus aureus desde a amamentação e podem albergar o microrganismo na nasofaringe ocasionalmente na pele e raramente na vagina A partir desses sítios o S aureus pode contaminar a pele e membranas mucosas do paciente objetos inanimados ou outros pacientes por contato direto ou por aerossol ocasionando infecções letais por conta dos fatores de virulência ou através de resistência aos antimicrobianos atualmente utilizados A identificação de estreptococos e estafilococos é baseada na morfologia que apresentam em meios líquidos Sendo o estreptococo uma cadeia normalmente longa e os estafilococos mostrandose em forma de cocos aos pares em cachos de uva 42 Unidade I A identificação presuntiva começa com a inoculação primária na placa de ágar sangue de carneiro que deve ser incubada em 5 de tensão de CO2 método da vela ou estufa de CO2 As colônias de estafilococos são geralmente maiores convexas de coloração variando do branco a amarelo podendo apresentar hemólise ou não Notase que o desenvolvimento da cor amarelada no S aureus ocorre somente após incubação prolongada 72 h a temperatura ambiente As colônias de estreptococos tendem a serem menores puntiformes e com halos de hemólise total ou parcial beta e alfahemólise A diferenciação entre os estreptococos e os estafilococos se dá seguramente pela prova da catalase O gênero Staphylococcus apresenta 32 espécies 14 subespécies sendo que somente 15 espécies são encontradas em amostras humanas e de uma maneira prática os estafilococos são divididos em duas categorias coagulase positivos e coagulase negativos de acordo com a resposta ao teste da plasmo coagulase Existem cerca de 31 espécies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas e as mais frequentes são Staphylococcus epidermidis causador de infecções de cateteres e próteses e o mais frequente microrganismo encontrado em hemoculturas Também associado a bacteremias e endocardites Staphylococcus saprophyticus causador de infecção urinária em mulheres jovens Staphylococcus haemolyticus importante devido à resistência aumentada aos antimicrobianos e por ser comumente confundido com o S aureus pois apresenta hemólise na placa de ágar sangue de carneiro A seguir são apresentados os principais testes utilizados na identificação Staphylococcus spp Prova da catalase Com a alça bacteriológica retirase uma colônia suspeita e esfregase em uma lâmina de vidro Despejar sobre esse esfregaço uma gota de água oxigenada a 3 e observar a formação de bolhas Para a família Micrococcaceae estafilococos a prova é geralmente positiva enquanto que para a família Streptococcaceae estreptococos é negativa Dessa forma podese utilizar dessa prova como um teste diferencial entre as duas famílias de bactérias Uma observação importante na realização dessa técnica devese tomar o cuidado de não carregar meio de cultura ágar sangue que pode acarretar resultados falsopositivos Teste da resistência a novobiocina A bactéria é semeada seguindo os cuidados da técnica de discodifusão de KirbyBauer acrescida de um disco teste de novobiocina contendo 5 µg As amostras resistentes mostram zonas de inibição de 6 a 12 mm enquanto as susceptíveis apresentam halos de 16 mm ou mais As cepas de Staphylococcus saprophyticus são resistentes 43 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA A forma mais simples de identificar o Staphylococcus aureus é a prova da coagulase que pode ser efetuada em tubo ou em lâmina Teste da coagulase em lâmina A maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada clumping factor fator aglutinante na superfície da parede celular que reage com o fibrinogênio do plasma causando sua coagulação Para se realizar o teste é muito simples devese inicialmente colocar duas gotas de salina em uma lâmina Depois homogeneizar com uma colônia isolada a ser testada acrescentar uma gota de plasma e misturar Devese observar se há aglutinação visível num prazo estabelecido de dez segundos Teste da DNAse Esse teste consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA DNAse test agar obtido comercialmente Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentração de 01 Incubar a 35 C por 24 horas e depois desse período verificar se há a presença de uma coloração rósea ao redor das colônias produtoras de DNAse indicando a positividade da prova Teste do crescimento em ágar manitol O Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio contendo 75 de NaCl denominado ágar manitol salgado ou meio de Chapman O indicador de pH é o vermelho de fenol que indica uma reação positiva quando o meio ao redor das colônias se torna amarelo e negativa quando permanece avermelhado Sensível Staphylococcus coagulase negativos Novobiocina Resistente Staphylococcus saprophyticcus Coagulase Negativa Positivo Staphylococcus aureus Manitol Coagulase DNAse Positivo Figura 18 Fluxograma resumido de identificação das principais espécies de Staphylococcus spp 44 Unidade I 22 Identificação presuntiva dos estreptococos A hemólise em meio de ágar sangue é um fator muito importante para a classificação das bactérias nesse grupo Sabese que bactérias podem produzir diferentes graus de hemólise a julgar pela concentração de hemolisina que cada uma pode produzir Bactérias que produzem altas concentrações de hemolisina provocando uma hemólise total quando semeadas em meio de ágar sangue são chamadas betahemolíticas Bactérias que produzem concentrações moderadas de hemolisina produzindo hemólise do tipo parcial são denominadas alfahemolíticas Já aquelas que não produzem hemólise por não produzirem hemolisina para tal são denominadas de gamahemolíticas Dessa forma o diagnóstico presuntivo de infecção por estreptococos iniciase obviamente pela microscopia revelando a presença de bactérias arredondadas grampositivas dispostas em cadeias curtas ou longas catalase negativos e observando o padrão de hemólise evidenciado Os estreptococos podem ser diferenciados de acordo com sua aparência na placa de ágar sangue após incubação a 35 C em presença de 5 de CO2 A identificação de espécie de estreptococos betahemolíticos é feita por meio de aglutinação com soros específicos contra os antígenos de Lancefield A B C D F e G que constitui uma prova rápida porém não acessível a todos os laboratórios em virtude do elevado custo Teste da bacitracina Esse teste é semelhante ao teste da novobiocina em termos de metodologia utilizada porém devese estar bastante atento pois depende da utilização de meio de ágar sangue cujos resultados podem gerar conflitos Para sua realização devese semear a placa de ágar sangue com o estreptococo a ser identificado colocar o disco de bacitracina 0004 u como indicado incubar por 24 horas a 35 ºC sem CO2 e verificar a presença de qualquer halo ou zona de inibição como resultado de sensibilidade O Streptococcus pyogenes grupo A é assim rapidamente identificado Teste do sulfametoxazol trimetoprim SXT Adicionar na mesma placa de ágar sangue onde foi realizado o teste da bacitracina o disco de SXT para tal podese dividir a placa ao meio Devese incubar por 24 horas a 35 C sem CO2 A sensibilidade a essa droga significa em conjunto com as outras leituras que o estreptococo não pertence ao grupo A B ou D de Lancefield Em adição como dito pode ser feito na mesma placa o teste de Bacitracina 0004 UI e o de Camp conforme a seguir 45 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA 1 Disco de bacitracina 2 Disco de sulfamentoxazol trimetoprim 3 Camp Test Linha horizontal estria com cepa beta hemolítica de Staphylococcus aureus ATCC 25923 Linhas verticais cepas teste 1 2 3 Figura 19 Testes de Bacitracina STX e Camp em uma mesma placa Fonte Anvisa sd Teste de camp Inocular uma estria única de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de betalisina ATCC25923 no centro de uma placa de ágar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro Na sequência devese inocular as amostras a serem testadas em estrias formando um ângulo reto com a linha de inoculação da amostra teste de estafilococo As estrias não devem se tocar ficando entre 1 e no máximo 2 mm de distância Desse modo várias amostras podem ser testadas em uma mesma placa de ágar sangue As placas devem ser incubadas em temperatura entre 3537 C durante um período de 1824 horas A positividade da prova Streptococcus agalactiae grupo B é evidenciada pelo alargamento da zona de análise que adquire a forma de ponta de flecha característica na área de intersecção entre as duas estrias Teste da bile esculina A prova da bile esculina avalia a capacidade de determinadas bactérias de hidrolisarem a esculina em esculetina em um meio contendo sais minerais e ferro A esculetina hidrolisada reage com os íons ferro gerando a formação de um induto preto no interior do tubo Para realizar a prova devese semear a bactéria em tubo contendo meio de bile esculina incubar em temperatura entre 3537 C durante um período de 1824 horas se houver formação de induto preto o teste é postivo mantendose a cor marrom do meio o teste é negativo O caldo de NaCl a 65 deve mostrar turvação para ser considerado positivo Teste do NaCl 65 No teste do NaCl 65 utilizase de um meio líquido também chamado de caldo onde adicionase uma solução de NaCl a 65 É sabido que muitas bactérias não resistem a tamanha concentração de sal Nesse caso as bactérias que conseguem sobreviver multiplicamse no meio graças aos nutrientes presentes turvandoo As bactérias que não resistem morrem e acabam por se depositar no fundo do tubo mantendo o meio translúcido 46 Unidade I Teste do PYR Esse teste determina a atividade do PYR também chamado pyrrolidonylaminopeptidase uma enzima produzida pelo Streptococcus pyogenes e também pelo Enterococcus sp Para se realizar o teste de maneira eficaz devese obrigatoriamente utilizar somente colônias puras Seguir as instruções do fabricante uma vez que se encontra disponível comercialmente Esse teste é tecnicamente equivalente à prova da hidrólise da bile esculina e crescimento em 65 de NaCl usados na identificação clássica dos enterococos e mais específico que o teste da bacitracina na caracterização presuntiva dos estreptococos betahemolíticos do grupo A tendo a vantagem de ser mais rápido Em qualquer dos dois casos o PYR constitui uma alternativa importante para esclarecer testes duvidosos Na impossibilidade da realização de testes sorológicos de confirmação reforçar o valor dos testes presuntivos clássicos de identificação do Streptococcus pyogenes Teste da optoquina Teste semelhante aos demais que utilizam como princípio a técnica de disco difusão para tal devese semear um quarto de uma placa de ágar sangue isso como opção caso queira utilizar a mesma placa para demais testes com a cepa alfahemolítica a ser testada Em sequência devese aplicar um disco de optoquina incubar a 35 C em tensão aumentada de CO2 sugerese uso do sistema de anaerobiose com gerador apropriado Após período de incubação notar se há presença de uma zona de inibição de 14 mm ou mais indicando sensibilidade ao teste e identificando de forma assertiva uma infecção por Streptococcus pneumoniae A seguir os quadros com a identificação presuntiva de bactérias do gênero estreptococos alfa beta e gamahemolíticas e na sequência as figuras apresentando os fluxogramas para identificação de bactérias do gênero estreptococos Quadro 4 Identificação de bactérias alfa hemolíticas Identificação Optoquina Bile esculina Tolerância NaCl 65 Pneumococo Sensível Negativo Negativo Enterococos Resistente Positivo Positivo Grupo viridans Resistente Negativo Negativo Streptococcus bovis Resistente Positivo Negativo Quadro 5 Identificação de bactérias beta hemolíticas Identificação Bacitracina Camp Teste Sensibilidade SXT Bileesculina e tolerância NaCl 65 S pyogenes Sensível Negativo Resistente Negativo Sagalactiae Resistente Positivo Resistente Positivo Enterococcus sp Resistente Negativo Resistente Negativo Estreptococcus não A B ou D Resistente Negativo Sensível Negativo 47 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Quadro 6 Identificação de bactérias gama hemolíticas Identificação Camp Teste BileEsculina Tolerância NaCl 65 S agalactiae Positivo Negativo Negativo Enterococcus sp Negativo Positivo Positivo Streptococcus bovis Negativo Positivo Negativo Catalase negativo Optoquina Bileesculina Tolerância a NaCl 65 Sensível Steptococcus pneumoniae Bileesculina positivo Enterococos Streptococcus bovis Tolerância NaCl 65 positiva Enterococos Alfahemólise Resistente Enterococos Grupo Viridans Streptococcus bovis Bileesculina negativo Grupo viridans Tolerância NaCl 65 negativa Sterptococcus bovis Figura 20 Fluxograma de identificação de bactéria alfa hemolítica Catalase negativo Bacitracina Teste Camp Sensível Estreptococos não A B ou D Resistente S agalactiae Enterococos Estreptococos não A B ou D Sensível Streptococcus pyogenes Teste Camp positivo Streptococcus agalactiaes Resistente Enterococos sp Betahemólise Teste Camp negativo Enterococos Estreptococos não A B ou D Sensibilidade a SXT Figura 21 Fluxograma de identificação de bactéria beta hemolíticas 48 Unidade I Catalase negativo Teste Camp Bileesculina negativo Streptococcus agalactiae Teste Camp negativo Enterococos Streptococcus bovis Teste Camp positivo Streptococcus agalactiae Bileesculina positivo Enterococos Streptococcus bovis Gamahemólise Tolerância a NaCl 65 Tolerância a NaCl 65 positiva Enterococos Tolerância NaCl 65 negativa Streptococcus bovis Figura 22 Fluxograma de identificação de bactéria gama hemolítica 23 Identificação presuntiva de Neisserias As várias espécies de Neisseria apresentamse morfologicamente como diplococos Gramnegativos lateralmente achatadas de aspecto riniforme lembram rins ou dois grãos de feijão unidos por uma ponte Apenas a espécie N elongata difere dessa morfologia sendo diplobacilos ou diplococobacilo Todas Neisserias são oxidase positivas e catalase positivas exceto Neisseria elongata e Kingella denitrificans Todas utilizam carboidratos por via oxidativa e não fermentativa sendo baixa a acidez de modo que podem acontecer reações duvidosas com o meio CTA cistyne tripticase agar com indicador vermelho de fenol que sempre foi muito utilizado em rotina No que tange aos aspectos clínicos a maioria das Neisserias é comensal vivendo em mucosas de humanos e animais As N gonorrhoeae crescem em ágar chocolate formando colônias pequenas As colônias de N meningitidis A e C capsuladas apresentamse com consistência mucoide Testes imunológicos não substituem a cultura e a bacterioscopia e para o diagnóstico da gonorreia existem kits de Elisa comerciais sondas genéticas de ácido nucléico PCR e suas variantes que se mostram altamente eficientes apesar de seu elevado custo No exame de um líquido céfalo raquidiano LCR com suspeita de infecção por Neisseria meningitidis pode ser feita a técnica de aglutinação com partículas de látex que é rápida com boa sensibilidade especificidade e permite a tipagem dos principais tipos prevalentes em meningites O teste pode ser positivo nos casos de cultura negativa por uso prévio de antimicrobianos sendo no entanto de custo elevado Para o tipo B alguns produtos oferecem testes para afastar reação cruzada com E coli A reação negativa não exclui o diagnóstico que deve ser sempre avaliado juntamente com a bacterioscopia e a cultura 49 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Na ocorrência de surtos de meningite meningocócica o diagnóstico presuntivo para fins de tratamento também pode basearse na clínica e na bacterioscopia do LCR ou de lesões petéquias e púrpuras As culturas devem sempre ser colhidas para confirmação identificação de sorotipo e sensibilidade aos antimicrobianos devese sempre fazer a bacterioscopia das colônias isoladas para confirmar a presença de diplococos Gramnegativos com forma de dois feijões o teste da oxidase das colônias sugestivas e devese procurar afastar outros gêneros de bactérias como Acinetobacter spp Kingella spp e Moraxella spp que são morfologicamente parecidos Para se evitarem resultados falsopositivos com identificação de Acinetobacter spp e Kingella spp como Neisserias devese semear o agente suspeito em ágar chocolate adicionar um disco de penicilina de 10 UI fazer leitura após 24 h e proceder uma coloração de Gram das colônias que crescerem próximas à zona de inibição Notar se as bactérias continuam a apresentar morfologia cocoides se sim confirmase o isolamento do contrário caso tenham adquirido a forma de bacilos longos o isolado não é de Neisseria Como recurso adicional importante recomendase enviar a cepa isolada rapidamente ao laboratório de referência para confirmação Teste de oxidase O teste da oxidase é um testechave para diferenciar entre as famílias de Pseudomonadaceae oxidase positiva e Enterobacteriaceae oxidase negativa A enzima citocromo oxidase está envolvida com a redução do oxigênio no final da cadeia de transporte de elétrons É útil no diagnóstico de infecções por Neisseria como dito anteriormente e é classicamente utilizada para executar a triagem dos BGN bacilos Gramnegativos não fermentadores da glicose uma vez que algumas bactérias utilizam este açúcar pela via oxidativa Convém rotineiramente se aplicar a pesquisa da oxidase principalmente aos BGN lactose negativos Utilizar tiras com reativo para oxidase adquiridas comercialmente Pingar uma gota de solução salina 085 estéril na tira de oxidase Com o auxílio de uma alça bacteriológica transferir assepticamente uma ou duas colônias da bactéria em análise e distribuir uniformemente sobre a superfície da área reagente da tira notar se em 2 minutos ocorre o desenvolvimento de uma coloração violeta caracterizando um teste de oxidase positiva Oxidase neg Oxidase pos Figura 23 Teste de oxidase negativo e positivo coloração violeta 50 Unidade I 24 Identificação presuntiva de bactérias anaeróbias Bactérias anaeróbias estritas configuramse como um grupo de bactérias capazes de causar doença aos seres humanos e animais e que não possuíam capacidade de multiplicarse em presença do oxigênio atmosférico Existem várias razões já descritas que buscam explicar a susceptibilidade dessas bactérias ao oxigênio entre elas Oxigênio seria um tóxico direto para a bactéria anaeróbia As bactérias anaeróbias estritas não têm a enzima catalase que impede a formação de grandes quantidades de peróxidos Oxigênio altera enzimas bacterianas importantes para o metabolismo bacteriano As bactérias anaeróbias estritas não possuem a enzima superóxido dismutase capaz de transformar o radical o que é altamente tóxico para a bactéria A susceptibilidade das bactérias anaeróbias estritas ao oxigênio mais do que justifica a dificuldade existente nos laboratórios para seu isolamento cultivo e estudo Por esse motivo também boa parte das infecções provocadas por esses microrganismos não eram diagnosticadas até a década de 1970 quando foram desenvolvidos procedimentos práticos de laboratórios para criar atmosferas de anaerobiose Um fato que também merece destaque a fim de explicar a frequência com que essas bactérias provocam infecção é que os anaeróbios estritos são habitantes normais do organismo humano ou seja são bactérias consideradas da microbiota residente ultrapassando em número os aeróbios e anaeróbios facultativos Dessa forma os anaeróbios estritos estão em proporções de cinco a mil vezes maiores que os anaeróbios facultativos na microbiota normal do tubo digestivo pele trato respiratório superior e genital feminino A existência de fatores predisponentes promove e podemos por que não dizer que facilitam os processos patológicos em diferentes órgãos e sistemas Por esse motivo a maior parte das infecções provocadas por anaeróbias estritas são denominadas de infecções endógenas por se tratar de um microrganismo da microbiota do próprio paciente As infecções provocadas pelo gênero Clostridium são fundamentalmente adquiridas a partir do meio ambiente externo e por esse motivo são chamadas de infecções exógenas Nas mucosas onde os anaeróbios estritos formam parte da flora normal existem condições locais de anaerobiose Essas condições são provocadas por compostos orgânicos enzimas restos celulares e bactérias anaeróbias facultativas que baixam o potencial redox nesses locais Nesse sentido devemos assinalar que essas bactérias toleram pequenas quantidades de oxigênio As mais estritas crescem em atmosferas com 51 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA 05 de oxigênio muitas crescem em atmosferas ao redor de 3 e algumas podem crescer ainda em concentrações de até 8 de oxigênio A existência como sugerido de bactérias anaeróbias facultativas e de aeróbias no mesmo sitio de infecção de bactérias anaeróbias estritas facilita o processo de infecção pelas anaeróbias justamente em razão do consumo de oxigênio que as demais espécies oxigêniodependentes fazem e sem dúvidas por também produzirem alguns fatores de crescimento como substâncias secundárias do seu metabolismo razões pelas quais a maior parte das infecções é por bactérias anaeróbias estritas mistas Assim são frequentes as infecções conjuntas com Enterobactérias Pseudomonas e Staphylococcus aureus Alguns aspectos clínicos fazem suspeitar uma infecção com envolvimento de bactérias anaeróbias sendo os principais secreção fétida infecção nas proximidades de superfície mucosa tecido necrótico presença de gás em tecidos ou secreções tromboflebite séptica coloração preta em secreção com sangue infecção decorrente de mordida humana ou de animal presença de grânulos de enxofre nas secreções terapêutica prévia com aminoglicosídeos gangrena gasosa A coleta de material biológico visando a uma investigação de bactérias anaeróbias também deve ser cercada de inúmeros cuidados Devese colher de forma que não entrem em contato com oxigênio e não se contaminem com bactérias anaeróbias da microbiota normal A maioria das amostras é colhida por punção aspirativa agulha e seringa na qual é eliminado o ar imediatamente após a obtenção da amostra Não devem ser semeados escarro secreção faríngea ou nasal secreções vaginais fezes ou material de colostomia pois esses materiais sempre têm bactérias anaeróbias 52 Unidade I As bactérias anaeróbias estritas são portanto pesquisadas em líquidos aspirados de cavidades fechadas material obtido por aspiração profunda de feridas punção de traqueia ou pulmonar e sangue para hemocultura O transporte da amostra colhida deve ser realizado com a mesma seringa com que foi colhido o material O material colhido deve sempre ser examinado partindose da de Gram Quando o material vem numa seringa a semeadura é feita em tioglicolato e em placa Quando o material já vem no meio de tioglicolato é feita a partir deste a semeadura em placa e incubados ambos os meios Como mencionado é fundamental uma atmosfera de anaerobiose para o isolamento e cultivo desses microrganismos para tal podese utilizar de vários recursos entre os quais destacamse dois de forma mais específica Câmaras anaeróbias glove box nas quais o manipulador introduz somente as mãos sendo o ar eliminado colocandose uma mistura de gases H2 CO2 N2 nessas câmaras existem todos os elementos necessários para o trabalho bacteriológico incluindo estufas de incubação Jarras de anaerobiose com geradores químicos que permitem obter uma atmosfera adequada para a multiplicação dessas bactérias Existem diversos tipos de geradores Os mais utilizados são os que provocam um consumo do oxigênio com substâncias redutoras como ferro reduzido ou ácido ascórbico Placas Gerador Figura 24 Jarra de anaerobiose com gerador químico Ambos os sistemas citados são igualmente eficientes porem o sistema de jarra é o mais prático e de melhor custobenefício A seguir veja o quadro com os principais gêneros e espécies de bactérias anaeróbias estritas de importância a seres humanos em função de sua morfologia e classificação morfotintorial frente à técnica de coloração de Gram 53 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Quadro 7 Principais grupos bacterianos classificados segundo método de coloração de Gram Classificação morfotintorial de Gram Agrupamento Bacteriano Cocos Grampositivos Peptostreptococcus sp Cocos Gramnegativos Veillonella sp Acidaminococcus sp Megasphaera sp Bacilos Grampositivos não esporulados Propionibacterium sp Bifidobacterium sp Actinomyces sp Eubacterium sp Lactobacillus sp Bacilos Grampositivos esporulados Clostridium sp Bacilos Gramnegativos Bacteroides sp Fusobacterium sp Prevotella sp Porphyromonas sp A identificação correta do agente bacteriano associado ao processo infeccioso sob investigação depende de forma bastante importante da execução rígida do protocolo a ser seguido A escolha dos meios de cultura as condições de cultivo a forma correta de colher e transportar o material como já informado são aspectos fundamentais para um bom resultado Não obstante ao protocolo de isolamento e cultivo o diagnóstico de gênero e espécie é feito utilizando de diferentes metodologias como provas bioquímicas utilização de açúcares produção de indol redução de nitratos urease crescimento em presença de bile liquefação da gelatina hidrólise de esculina produção de pigmentos hemólise susceptibilidade a antimicrobianos Nesse sentido o fluxograma a seguir apresenta uma possibilidade de protocolo de execução de cultura a partir de material líquido ou purulento baseado em recomendações da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e do CLSI para a cultura e processamento de amostras suspeitas contendo bactérias anaeróbias bem como uma tabela com os resultados esperados em alguns testes de referência e o agente etiológico respectivamente associado Amostra material líquido ou purulento Inoculação em caldo tioglicolato THIO em anaerobiose 48 h a 7 dias 35 C Ágar sangue anaeróbio Asana Ágar sangue Gram Ágar bacteroides bile esculina BBE Ágar chocolate Semeadura em placas Ágar MacConckey Incubar em aerobiose a 35 C 24 a 48 h Incubar anaerobiose 35 C 24 a 48 h Incubar em CO2 a 35C 24 a 48 h Figura 25 Fluxograma de identificação de bactérias anaeróbias 54 Unidade I A título de exemplificação segue tabela de identificação de algumas bactérias anaeróbias com os resultados de cada teste Quadro 8 Identificação de bactérias anaeróbias Bactéria Rifampicina 15 mcg Kanamicina 1000 mcg Indol Pigmento Grupos Bacteroides fragilis Sensível Resistente Positivonegativo Negativo Prevotella sp Sensível Resistente Positivonegativo Positivo Porphyromonas sp Sensível Resistente Positivo Positivo Bacteroides sp Sensível Sensívelresistente Negativo F mortiferum Resistente Sensível Negativo Negativo F varium Resistente Sensível Positivo Negativo Fusobacterium spp Sensível Sensível Positivo Negativo Notase que para Rifampicina e Kanamicina o resultado é resistente quando os halos medidos forem menores que 12 mm importante observar que o inóculo para o teste deve ser equivalente à escala 3 de McFarland diferente do utilizado em outras situações em que o inóculo normalmente corresponde à escala 05 de McFarland Para a produção de pigmento recomendamos a observação direta das colônias e caso não exista pigmento evidente iluminar a placa com luz ultravioleta 360 mm de comprimento de onda Colônias de Prevotella melaninogenica aparecem com cor tijolo avermelhado e de Porphyromonas gingivalis com coloração escurecida Para a prova de indol retirase uma colônia do meio com triptofano com ajuda de uma alça de platina num papel filtro impregnado em 1 de paradimetilaminocinamaldeido em ácido clorídrico 10 Uma reação positiva produz imediatamente uma cor azul Saiba mais A carga de bactérias anaeróbias que colonizam o organismo humano é vasta correspondendo a cerca de 90 da biomassa humana A relação biótica entre o ser humano e a sua microbiota configura benefícios recíprocos embora com potencial patogênico para o ser humano em situações de disbiose Infecções com ponto de partida ou em contiguidade com a pele ou mucosas do trato intestinal geniturinário ou respiratório alto são frequentemente polimicrobianas devido às bactérias anaeróbias serem invariavelmente contempladas no diagnóstico diferencial etiológico dessas situações Para saber mais sobre bactérias anaeróbias e sua importância leia ALVES J et al Bactérias anaeróbias com relevância clínica classificação taxonômica e morfológica presença na microbiota humana e diagnóstico microbiológico Acta Med Port v 30 n 5 p 409417 maio 2017 Disponível em httpsbitly3hz2Zxp Acesso em 29 jun 2021 55 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA 3 IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS BACILOS GRAMNEGATIVOS NÃO FERMENTADORES E BACILOS CURVOS ESPIRALADOS 31 Identificação presuntiva de enterobactérias A família das Enterobacteriaceae compreende um largo número de espécies bacterianas de importância médica Essas espécies respondem por mais de 70 dos isolados bacterianos na rotina do laboratório clínico sendo responsáveis por diferentes agravos infectocontagiosos como gastroenterites bacteremias infecções urinárias infecções de feridas meningites etc Estão intimamente associadas a diferentes mecanismos de resistência bacteriana sobretudo no ambiente hospitalar Em termos morfológicos todas as espécies apresentam um aspecto bacilar eou cocobacilar adquirem coloração rosavermelha após coloração de Gram apresentando uma bioquímica de fermentação são oxidase negativa anaeróbias facultativas reduzem nitrato a nitrito não apresentando a capacidade de formar esporos A primeira etapa para a identificação de uma enterobactéria patogênica é o semeio da amostra em um meio de cultura seletivo e diferencial Os meios mais utilizados para essa finalidade são ágar eosina azul de metileno ágar EMB também chamado de ágar teague ágar MacConkey ágar SalmonellaShigella ágar SS ágar xiloselisinadesoxicolato XLD e o ágar entérico Hektoen HE Ágar EMB Nesse meio os típicos fermentadores da lactose especialmente a Escherichia coli produzem colônias de coloração escura apresentando um brilho metálico de tom esverdeado devido à alta produção de ácidos Produtores mais fracos de ácido Klebsiella Enterobacter Serratia formam colônias geralmente acinzentadas Os não fermentadores de lactose Shigella e Salmonella por exemplo produzem colônias transparentes Figura 26 Agar BEM Detalhe das colônias verdes metálicas características de Escherichia coli Adaptada de httpsbitly2SEI17M Acesso em 29 jun 2021 56 Unidade I Ágar MacConkey MC A presença de cristal violeta na constituição desse meio impede o crescimento de bactérias Grampositivas especialmente estafilococos e enterococos Os típicos fermentadores de lactose formam colônias cor de rosavermelha as amostras lactose negativas apresentamse incolores ou transparentes Ágar SalmonellaShigella SS Os meios SS XLD e HE são empregados no laboratório clínico geralmente para o isolamento de espécies de Salmonella e Shigella a partir de amostras de fezes diarreicas ou em laboratórios de saúde pública para investigar uma possível contaminação fecal de alimentos e reservatórios de água A incorporação de lactose ao meio SS permite diferenciar entre bactérias fermentadoras de lactose e não fermentadoras As primeiras formam colônias de aspecto avermelhado já as que não fermentam lactose geram colônias transparentes Uma característica importante desse meio é a presença de tiossulfato de sódio e citrato férrico o que permite a detecção de H2S evidenciado pela formação de pigmentação preta no centro das colônias Provas para identificação de enterobactérias Teste do tríplice açúcar ferro TSI A prova do TSI é realizada utilizando o meio conhecido como ágar TSI É extremamente importante no processo de identificação permitindo a diferenciação de bacilo gramnegativos fermentadores de não fermentadores ou de fermentadores lentos O meio tem uma coloração vermelho alaranjada quando não inoculado apresentase em tubo e no formato inclinado Esse meio em sua composição é formado por três açúcares 01 de glicose 10 lactose 10 sacarose vermelho de fenol como indicador de pH para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro para detecção da produção de H2S 1 2 3 4 Figura 27 Teste do tríplice açúcar ferro 1 glicose positiva e H2S positivo 2 glicose positiva lactose e sacarose negativas 3 glicose lactose sacarose positivas e gás positivo notar rompimento do meio por produção excessiva de gás no interior do tubo 4 glicose lactose e sacarose negativas provável bacilo gramnegativo não fermentador 57 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA A semeadura se faz introduzindo a agulha bacteriológica por picada até o fundo do tubo seguido por estriamento na superfície inclinada essa configuração origina duas zonas de reação dentro do mesmo tubo a porção inclinada superfície e a porção inferior denominada base O meio então é incubado a 3537 ºC por 1824 horas A fermentação é indicada pela mudança de cor do indicador vermelho de fenol de vermelho para amarelo Considerandose que todos os membros da família Enterobacteriaceae são fermentadores de glicose a ausência de alteração ou leve mudança para púrpura no meio de TSI caracteriza o indício da presença de bastonetes Gramnegativos não fermentadores Pseudomonas por exemplo os quais apresentam um esquema próprio de identificação Ágar SIM teste sulfetoindolmotilidade Meio utilizado na identificação de enterobactérias permitindo a verificação na produção de indol produção de H2S e determinação de motilidade Indol a formação de indol acontece pela metabolização do aminoácido triptofano presente no meio por bactérias produtoras de triptofanase Quando a bactéria é produtora da enzima triptofanase promove a desaminação do triptofano gerando ácido pirúvico amônia e indol O indol pode ser detectado pela adição do reativo de Kovacs ao tubo com crescimento Nos casos positivos formase um anel avermelhado na superfície do tubo H2S a formação de H2S é detectada pela presença de tiossulfato de sódio e ferro no meio o que promove a formação de sulfitos insolúveis que quando precipitados denotam uma coloração preta ao meio Motilidade a prova da motilidade avalia de forma indireta a presença de flagelos na bactéria que está sendo identificada Para a realização do teste é condição fundamental o uso de meio semissólido a fim de permitir a dispersão das bactérias pelo meio em busca de nutrientes O resultado é obtido pela visualização macroscópica do tubo observandose uma área de intensa turvação ao redor da picada de inoculação A semeadura é feita com a agulha bacteriológica em picada seguida de incubação a 3537 ºC por 1824 horas Devese observar a motilidade antes de pingar algumas gotas de reativo de Kovacs o pigmento escurecido se existir será a primeira característica notada A B Figura 28 Provateste Indol Notase anel vermelho indicando resultado positivo A resultado negativo B 58 Unidade I A B Figura 29 Provateste motilidade A notase meio turvo sendo positivo B meio límpido e crescimento somente no local da picada sendo negativo Teste do citrato de Simmons Verifica a capacidade da bactéria de usar o citrato como única fonte de carbono Caso a bactéria utilize somente o citrato de sódio como fonte de carbono o nitrogênio também é extraído do fosfato de amônio contido no meio liberando amônia nessas condições ocorre uma alcalinização do meio alterando sua cor de verde para azul intenso O indicador de reação é o azul de bromotimol Identificase uma amostra como positiva pela mudança da cor do meio de verde para azul Exemplos de bactérias citrato positivo são Salmonella sp e Klebsiella sp A B Figura 30 Provateste citrato de Simons A notase coloração azul sendo positivo B resultado negativo Teste da urease ágar ureia de Christensen Algumas enterobactérias apresentam a capacidade de degradar a ureia por meio da ação da enzima urease que acaba como resultado final formando duas moléculas de amônia e alcalinizando o meio O meio de ureia de Christensen tem originalmente uma coloração amarelolaranja e as bactérias produtoras de urease provocam uma mudança de cor para rosavermelho 59 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA A B Figura 31 Provateste urease A notase coloração rosa caso positivo B resultado negativo Teste do vermelho de metila VM e VogesProskauer VP Para a identificação de enterobactérias também podemos nos valer de testes que avaliem a via de metabolização do piruvato utilizado por bactérias As enterobactérias fermentam a glicose por meio da via de EmbdenMeyerhof a fim de formar ácido pirúvico mas a forma de utilização pode ocorrer por outras duas vias conhecidas como ácida mista ou butilenoglicólica O teste de VM e VP revela por qual dessas duas vias ocorre a utilização do piruvato VM via ácida mista VP via butilenoglicólica Para a realização do teste utilizase um caldo meio líquido à base de peptona fosfato de potássio e grande concentração de glicose Para a realização dos testes serão utilizados dois tubos idênticos identificados como VM e VP No tubo indicado para VM pingamse após inoculação com a bactéria a ser investigada por 24 horas a 3537 C algumas gotas de vermelho de metila para verificar a produção ou não de ácidos mistos sobretudo ácido láctico acético e fórmico suficientes para manter o pH abaixo de 44 A cor do meio que é naturalmente branca ficará completamente vermelha após a adição do vermelho de metila No tubo indicado para o teste de VP pingase uma solução de hidróxido de potássio KOH e em seguida algumas gotas de alfanaftol após inoculação com a bactéria a ser investigada por 24 horas a 3537 C A visualização do resultado é a mesma presença de coloração vermelha As bactérias que utilizam a via do butileno glicol como certas cepas do grupo KlebsiellaEnterobacterSerratiaHafnia produzem apenas pequenas quantidades de ácidos mistos que podem ser insuficientes para reduzir o pH do meio contendo vermelho de metila e produzir mudança de cor Em consequência as espécies de Enterobacteriaceae que são VP positivas são na maioria das vezes VM negativas e viceversa 60 Unidade I Figura 32 Provateste VMVP Notase coloração vermelha revelando positividade para o teste Os resultados são autoexcludentes ou seja se VM positivo VP será negativo e viceversa Teste da fenilalanina desaminase ágar de fenilalanina O teste avalia a capacidade de formação de ácido fenilpirúvico a partir da ação da fenilalanina desaminase Para tal utilizase o meio de fenilalanina A bactéria se produtora da enzima fenilalanina desaminase FAD degrada a fenilalanina do meio formando ácido fenilpirúvico A revelação do teste é feita após o período de incubação adicionandose ao meio algumas gotas de cloreto férrico a 10 como indicador do meio O meio que é normalmente de coloração branca apresentará uma mudança de cor para verde sobretudo na área da rampa ou superfície do meio Esse teste é útil para diferenciação inicial de espécies de Proteus sp Morganella sp e Providencia sp de outros bacilos Gramnegativos Apenas os membros desses gêneros e alguns microrganismos isolados relativamente raros do grupo Enterobacter sp possuem a enzima responsável pela desaminação oxidativa da fenilalanina FAD FAD Figura 33 Provateste FAD Notase coloração verde na superfícierampa do tubo 61 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Teste da lisina descarboxilase LDC ou teste da descarboxilação de lisina arginina e ornitina Verifica a presença de uma enzima denominada lisina descarboxilase ornitina descarboxilase e da arginina dehidrolase exceção no grupo No teste avaliase a capacidade das bactérias de descarboxilar os aminoácidos presentes no meio de cultura As enzimas removem de diferentes formas as moléculas de CO2 de um aminoácido para formar aminas de reação alcalina gerando como produtos desse processo Lisina cadaverina Arginina citrulina Ornitina putrescina Visto que a conversão da arginina em citrulina não ocorre por ação de uma descarboxilase mas sim de uma dehidrolase o grupo NH2 é retirado da arginina como primeira etapa em seguida a citrulina é convertida em ornitina que sofre descarboxilação para gerar putrescina Os testes podem ser feitos em meio líquido ou em meio semissólido contendo cada tubo um aminoácido especifico os testes são independentes podendo ser feitos todos em separado e os resultados analisados em conjunto com as demais provas ou testes Um pH abaixo de 55 é a condição ideal para a ação das enzimas Caso a bactéria analisada possua uma descarboxilase ou dehidrolase para o aminoácido teste essa reação irá alcalinizar o meio devolvendo sua cor púrpura original Sendo assim a positividade do teste é dada pela manutenção da cor púrpura após o período de incubação A mudança de cor indica a produção de ácidos pela fermentação ou quebra da glicose e um teste negativo esse é o único teste cuja mudança de cor exibe um resultado negativo A B Figura 34 Provateste LDC A notase coloração púrpura original e mantida após inoculação na superfície B tubo de meio com coloração amarela após inoculação indicando resultado negativo para o aminoácido testado 62 Unidade I A identificação de Enterobactérias é realizada portanto com base na análise em separado de cada teste em termos de resultado positivo ou negativo e pela análise conjunta de todos os resultados No quadro a seguir estão indicados os resultados positivos ou negativos para os diversos testes para as principais enterobactérias de importância clínica Quadro 9 Identificação das principais bactérias da família Enterobacteriaceae Bactérias IND CIT H2S URE FAD LDC MOT GÁS LAC Citrobacter freundii V Edwardsiella tarda Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae V Escherichia coli Salmonella spp Salmonella typhi Salmonella paratyphi Serratia marcescens Shigella dysenteriae Shigella flexneri Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Morganella morganii Proteus mirabilis Proteus vulgaris INDINDOL CITCITRATO UREUREIA FADFENILALANINA DESAMINASE LDC LISINA DESCARBOXILASE MOT MOTILIDADE LAC LACTOSE 55 ou mais das cepas são positivas 55 ou mais das cepas são negativas V proporção de cepas com resultados positivos ou negativos em torno de 50 Cepas 100 positivas Cepas 100 negativas Lembrete Essa tabela foi elaborada com base nas orientações para identificação de BGN da família Enterobacteriaceae publicada pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária Esteja sempre atento às atualizações e informes da Anvisa e publicações do CLSI 32 Identificação presuntiva de bacilos Gramnegativos não fermentadores Os bacilos Gramnegativos não fermentadores BNFs são bactérias aeróbias não esporuladas incapazes de utilizar carboidratos como fonte de energia por meio de fermentação degradandoos pela via oxidativa 63 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Os BNFs são de grande importância nos casos de infecção hospitalar geralmente relacionados com resistência elevada a vários antibióticos sobretudo em infecções graves O número de bactérias não fermentadoras conhecidas é muito grande Para o isolamento de BNFs é comum utilizar inicialmente de meios como ágar MacConkey e ágar sangue O microbiologista pode suspeitar de que um bacilo Gramnegativo desconhecido que cresça em algum desses ou nos dois meios seja membro do grupo não fermentador caso ele apresente ausência de evidências de fermentação da glicose o que pode ser confirmado pela semeadura em TSI São exemplos bastante importantes de BNFs a Pseudomonas sp e Acinetobacter sp Moraxella sp entre outros A seguir são destacadas as principais provas para a identificação de bactérias não fermentadoras Prova da oxidase Essa prova é simples e de fácil realização visto que já existem no mercado várias tiras ou fitas contendo reativos específicos para tal Nesse caso basta fazer a seleção da colônia suspeita a partir de uma placa semeada de MacConkey ou ágar sangue retirála da placa com um palito de madeira preferencialmente e espalhar a colônia na área de teste na tira papel de filtro saturado com o reagente tal como pode ser observado na figura seguinte A positividade do teste é dada pelo aparecimento de uma coloração arroxeada indicando atividade de citocromo oxidase Pos Neg Figura 35 Teste de oxidase indicando Positividade nos casos de BNFs Produção de pigmento Os não fermentadores produzem diversos pigmentos alguns dos quais são úteis para identificar uma espécie No caso da Pseudomonas sp é importante destacar a produção de piocianina um pigmento que confere ao meio de cultura e às colônias bacterianas um tom azulado como pode ser observado na figura a seguir 64 Unidade I Figura 36 Produção de pigmento piocianina típico de crescimento por Pseudomonas aeruginosa Prova de oxidação e fermentação OF Esse teste avalia a capacidade do BNF em utilizar os carboidratos por meio de uma das duas possíveis vias seja a via oxidativa ou a via fermentativa O meio OF pode ser utilizado como base para verificar a metabolização de diversos açúcares glicose frutose lactose maltose manitol sacarose xilose Utilizase para a realização do teste um meio de ágar base acrescido do açúcar que se deseja testar Normalmente utilizase o OFglicose Nesse teste são necessários dois tubos para cada açúcar a ser testado Um dos tubos deve estar com a entrada de ar oclusa por meio de uma camada de óleo mineral impedindo a dispersão no meio do oxigênio As bactérias oxidativas produzem ácidos apenas no tubo aberto exposto ao oxigênio atmosférico as bactérias fermentadoras produzem ácidos em ambos os tubos e as bactérias não sacarolíticas permanecem inertes nesse meio O indicador é o azul de bromotimol a cor amarela indica fermentação A Óleo Óleo Aberto sem óleo C B Figura 37 A meio de OFglicose para teste de OFtubo Fermentação positiva bactéria fermentadora B e C Tubos positivos para bactéria não fermentadora Observe que bactérias oxidativas não são capazes de fermentar a glicose no tubo fechado preservando a cor original do meio verde e quando em contato com o oxigênio promovem oxidação amarelo 65 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Crescimento em caldo tryptic soy broth TSB a 42 C Para esse teste utilizase o meio de TSB na forma de caldo ou seja meio liquido Para tal retirase de 2 a 3 colônias da placa de ágar MacConckey ou ágar sangue e inoculase no interior do meio de TSB agitando com alça bacteriológica estéril ou devidamente flambada Após agitação devese incubar o tubo a temperatura de 42 C e após período de incubação devese notar se houve crescimento bacteriano por turvação característica do meio ou não meio límpido A B Figura 38 Teste do crescimento em TSB 42 C indicando A negativo e B positivo Além dos testes explicitados adicionalmente ainda são realizados outros testes os quais também são realizados para bactérias Gramnegativas fermentadoras da família das enterobactérias como testes de urease citrato motilidade lisina e bileesculina nesse caso para grupo dos estreptococos Dessa forma também nos baseamos em tabelas de identificação recomendadas pela Anvisa para a correta identificação de bacilos Gramnegativos não fermentadores em todas suas especificidades em termos de gêneros e espécies 33 Identificação presuntiva de bacilos curvos espiralados Os denominados bacilos curvos ou espiralados são em sua maioria de frequência rara no laboratório de microbiologia com exceção das cepas de Campylobacter sp e por essa razão é uma recomendação da Anvisa que a identificação desses agentes quando de testes ou exames morfológicos sugestivos deva ser feita por profissionais dos laboratórios de referência Entre as bactérias pertencentes a esse grupo podese destacar a Leptospira sp causadora da leptospirose que tem como reservatório cães gatos porcos e ratos e cuja transmissão ocorre principalmente por meio da água e alimentos contaminados Podese destacar também o Helicobacter pylori associado aos quadros de úlcera péptica e gastrite sobretudo em humanos macacos e felinos e cuja transmissão é fecaloral Não obstante ainda como membro importante desse grupo destacamse as bactérias do gênero Vibrio sp obviamente associadas com gastroenterites bastante produtivas e cuja principal via de transmissão é a água e os alimentos 66 Unidade I Nos casos de suspeita de infecção por Campylobacter jejuni ou Campylobacter fetus principal espécie associada a infecções extraintestinais devese colher material fecal em meio de transporte conhecido como CaryBlair Tão logo o material chegue ao laboratório deve ser submetido a uma microscopia utilizando a técnica de Gram recomendase a utilização da fucsina a 01 por 2 minutos diferente do que é realizado no teste convencional É comum observar a presença de inúmeros leucócitos na amostra corada mas a cultura sempre deve ser preconizada independentemente da presença ou ausência de leucócitos na matéria fecal O Gram da amostra fecal por inúmeros estudos apresenta uma sensibilidade em torno de 7090 e elevada especificidade A maioria das espécies de Campylobacter é microaerofila exigindo entre 5 e 10 de CO2 e 85 de N2 Para tal devese utilizar geradores específicos para microaerofila ou estufa de CO2 Já para o isolamento podem ser utilizados diversos meios de cultura específicos sendo o mais utilizado o ágar carvão desoxicolato cefoperazona o meio Campy e o meio de Karmali Para a identificação presuntiva de Campylobacter e suas espécies várias provas são realizadas algumas das quais já debatidas em capítulos anteriores como a prova da catalase H2S TSI crescimento a 25 C crescimento a 42 C crescimento em ágar MacConkey teste de sensibilidade ao ácido nalidíxico e à cefalotina As provas que se baseiam no crescimento em meios submetidos a diferentes temperaturas se baseiam na capacidade de a bactéria se adaptar em temperaturas mesófilas ou termofilias acima de 40 C A maioria das espécies de Campylobacter são termofílicas com a exceção de Campylobacter fetus mesófila Os testes de sensibilidade utilizam do princípio da técnica de discodifusão de KirbyBauer e avaliam o perfil de sensibilidade ou resistência de cada espécie Os resultados para as principais espécies de Campylobacter sp podem ser observados no quadro a seguir Quadro 10 Identificação das principais bactérias da familia Enterobacteriaceae Bactérias CAT H2S TSI Cresc 25 C Cresc 42 C MacConkey NAL CEF Campylobacter jejuni v res Campylobacter coli sen res Campylobacter fetus v sen CATCATALASE TSI TRIPLICE AÇÚCAR FERRO NAL ÁCIDO NALIDÍXICO CEFCEFALOTINA 55 ou mais das cepas são positivas 55 ou mais das cepas são negativas V proporção de cepas com resultados positivos ou negativos ou resistentessensíveis em torno de 50 Cepas 100 positivas Cepas 100 negativas res cepas resistentes sen cepas sensíveis 67 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA 4 PROTOCOLOS ESPECIAIS NO DIAGNÓSTICO EM BACTERIOLOGIA CLÍNICA 41 Urocultura Inúmeras situações podem demandar a cultura de amostras de urina sobretudo quando existe suspeita de infecções do trato urinário no controle terapêutico eou em pacientes assintomáticos os quais podem apresentar alto risco de infecção As infecções do trato urinário ITU apresentamse como as mais comuns na prática clínica atingindo sobretudo crianças e adultos entre eles do sexo feminino são as mais susceptíveis A susceptibilidade natural de pacientes do sexo feminino se explica em funções de diferenças anatômicas como o tamanho da uretra mulheres apresentam uretra 4 a 5 vezes menor que os homens variando na mulher entre 45 cm e nos homens por volta de 20 cm a proximidade da abertura genital com o poro anal fatores hormonais gestação entre outras situações As infecções urinárias podem vir a ocorrer em diferentes grupos etários desde neonatos a idosos com idade acima de 65 anos nos quais as ITU ocorrem quase que indistintamente entre ambos os sexos Em idosos a elevada frequência de ITU associase a doenças de base como hipertrofia prostática e cistocele condições que dificultam o esvaziamento normal da bexiga e o aumento do pH vaginal As infecções do trato urinário podem em razão de sua topografia ou localização serem classificadas em ITUs altas quando atingem sobretudo o parênquima renal eou os ureteres respectivamente conhecidas pelos nomes de pielonefrite e ureterites Quando baixas atingem bexiga uretra e particularmente nos homens a próstata e o epidídimo episódios clinicamente denominados de cistite uretrite prostatite e epididimite A pielonefrite é caracterizada clinicamente por febre calafrios náuseas vômitos e dor posterior e região dos flancos é comum apresentarse como assintomática nas situações crônicas A cistite é caracterizada por disúria ou seja uma dificuldade para urinar muitas vezes acompanhada de sintomas como ardência dor eou desconforto ao urinar Uretrite também é caracterizada por disúria e poliúria ou seja um aumento significativo da frequência miccional muitas vezes acompanhadas de corrimento uretral São inúmeros os agentes que podem ser frequentemente implicados com ITU sendo os mais frequentes agentes etiológicos as bactérias da família Enterobacteriaceae tais como Escherichia coli Grupo CESP Citrobacter spp Enterobacter spp Serratia spp Proteus spp e Klebsiella spp Entre os grampositivos sobretudo do grupo dos cocos destacamse Staphylococcus saprophyticus e o Enterococcus spp As ITU podem ocorrer de várias formas e com manifestações clínicas diferentes podendo variar desde episódios únicos pouco frequentes a situações de infecções de longa duração denominadas comumente de crônicas São consideradas ITU isoladas ou únicas quando o evento ocorre de forma isolada sendo tratada com antibioticoterapia convencional ITUs recidivantes são determinadas quando ocorre falha terapêutica o 68 Unidade I que se percebe nitidamente em razão da persistência de um mesmo microrganismo isolado em situações anteriores tal condição pode levar a uma infecção persistente também conhecida como crônica a qual pode ser sintomática ou assintomática Quando uma paciente apresenta frequente ITU por agentes microbianos diferentes ou seja sem relação entre os diferentes episódios ocorridos anteriormente classificase a infecção como sendo uma situação de reinfecção e não deve ser confundida com situações de infecções do trato urinário crônicas ITUs crônicas caracterizamse por apresentar a manutenção do mesmo microrganismo por longos períodos muitas vezes meses e ou anos durante os quais são extremamente comuns os episódios de recidivas póstratamento Para o diagnóstico de ITU devese utilizar de urocultura por ser considerado exame padrão também conhecido como goldstandard No entanto para uma realização e interpretação perfeita dos resultados o exame revestese de uma série de cuidados os quais devem ser observados Para a realização do procedimento preconizase preferencialmente a utilização da primeira amostra ou seja a coleta e utilização da primeira urina da manhã sempre em frasco estéril de boca larga e tampa de rosca e preferencialmente antes da utilização de antibióticos eou outros medicamentos Na impossibilidade de se colher a primeira amostra da manhã ou por orientação da unidade laboratorial podese colher outras amostras desde que o paciente seja devidamente orientado a manter uma retenção vesical de pelo menos 2 a 3 horas Para uma execução e interpretação segura da urocultura são informações úteis a serem consideradas se o paciente apresenta indícios eou sintomas de infecção urinária bem como leucocitúria se do sexo feminino se é gestante bem como a idade do paciente independentemente do sexo o tipo de coleta empregado e o uso prévio de antibióticos 411 Tipos de amostra Jato médio considerada a amostra ideal é aquela colhida por jato médio espontâneo do qual devese inicialmente proceder como uma rigorosa assepsia da região genital desprezar o primeiro jato de urina ou até obter a sensação de esvaziamento parcial da bexiga e colher a amostra em frasco estéril desprezando o volume residual Saco coletor comumente utilizado em crianças sobretudo neonatos e lactentes que não respondem a comandos Nesses casos utilizase de saco coletor estéril apropriado e devidamente identificado Devese para tal proceder com a assepsia prévia da região genital e aplicar o saco coletor de maneira asséptica Promover a substituição do saco coletor em intervalos que podem variar de 45 a 60 minutos sempre zelando pelo procedimento asséptico até o momento da coleta do material O setor técnico responsável pelo processamento da amostra deve receber o saco 69 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA coletor perfeitamente vedado sob o risco de rejeitar a amostra por contaminação do material Em crianças que utilizam fraldas é fundamental zelar para que não ocorra contaminação da amostra com material fecal Em pacientes em condições especiais com recémnascidos e lactentes de baixo peso importante avaliar a indicação de punção vesical suprapúbica Punção vesical suprapúbica metodologia pouco utilizada sendo recomendada para crianças menores de 2 anos de idade ou para pesquisa de bactérias anaeróbias Para se colher tal material utilizase de agulha e seringa estéril e se procede com a punção vesical Coleta de sonda vesical embora não recomendada em razão da grande possibilidade de contaminação por microrganismos sobretudo aqueles formadores de biofilme o procedimento pode ser realizado pinçandose a cânula do coletor proceder com sua desinfecção com solução degerminante álcool 70 e com agulha e seringa estéril puncionar a cânula e retirar por volta de 10 ml de urina transferindoa para frasco estéril para posterior processamento da amostra Uma vez colhidas as amostras são estáveis a temperatura ambiente por no máximo 2 horas passado esse tempo a amostra deve ser refrigerada a temperatura entre 2 e 8 C e processadas em até 24 horas Se a amostra for colhida utilizandose de conservante como no caso do ácido bórico a amostra pode ser mantida em temperatura ambiente entre 2025 C por até 24 horas antes de vir a ser processada Quanto ao volume recomendado solicitase que não seja inferior a 2 ml e se a amostra tiver de ser submetida em paralelo ao exame de urina tipo 1 que não seja inferior a 10 ml 412 Procedimento Em amostras de urinas em que a análise microscópica de amostra não centrifugada revela dois ou mais microrganismos de mesma característica morfológica por campo sugerese uma correlação com contagem igual eou superior a 105 UFCml A presença de microrganismos de tipos morfológicos distintos e numerosas células epiteliais eou cristais eou cilindros pode indicar contaminação de amostra Microscopia de Gram Homogeneizar e não centrifugar a amostra Deixar secar em temperatura ambiente e fixar sobre a chama Retirar 10 µl de amostra e aplicar sobre uma lâmina Reportar o número de microrganismos observados em aumento de 100x Figura 39 Algoritmo para análise microscópica de amostra de urina não centrifugada reportar o número de microrganismos como raros frequentes ou numerosos Para se proceder com a urocultura devese utilizar da semeadura conhecida como semiquantitativa em placa conforme esquema a seguir 70 Unidade I Homogeneizar a amostra sem centrifugar Imergir alça calibrada de 001 ou 0001 ml Semear em ágar Cled Fazer semeadura semiquantitativa Incubar em estufa bacteriológica a 35 1 C entre 1824 horas contagem Semear em ágar MacConkey Figura 40 Algoritmo para urocultura proceder à contagem de colônias Existem muitas circunstâncias nas quais é necessário avaliar quantitativamente a população bacteriana entre as quais na avaliação de um paciente com infecção do trato urinário Para tal são descritas inúmeras técnicas como a partir da contagem através de aparelhos eletrônicos pela contagem por microscopia ou por análise turbidimétrica na qual considerase que a turvação é proporcional à quantidade de bactérias existentes Alguns métodos podem ser empregados para se determinar o número de bactérias viáveis tanto quanto não viáveis Para a determinação do número de bactérias viáveis o método clássico é conhecido como método de contagem de colônias em placas o qual se baseia que cada bactéria no meio de cultura dará origem a uma colônia assim trabalhando com volumes conhecidos e contando o número de colônias que cresceram é possível avaliar o número de microrganismos viáveis por volume de amostra A diluição da amostra não é um requisito obrigatório para o método de contagem no entanto pode ser utilizado a fim de propiciar uma contagem e identificação mais precisa das colônias bacterianas Nesse caso devese proceder à contagem e depois a correção em função da diluição da amostra podendose aplicar a seguinte fórmula N C X D X FC Onde N número de bactérias viáveisml de amostra D diluição C número de colônias contadas na placa Fc fator de correção do volume quando forem semeados 01 ml multiplicase por 10 O resultado é sempre expresso em unidades formadoras de colônias UFC por ml 71 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Para uma interpretação segura e coerente da urocultura devese levar em consideração não apenas a contagem de microrganismos mas também a presença eou ausência de leucócitos e se possível a presença eou ausência de sintomas Quando as contagens de colônias forem inferiores a 105 UFCml mas houver presença de um único microrganismo potencialmente patogênico e ausência de informações clínicas considerar uma possível infecção do trato urinário São considerados possíveis contaminantes de amostras Lactobacillus Staphylococcus coagulase negativo difteroides entre outros Os algoritmos para urocultura com contagem superior a 105 UFC podem ser observados na figura a seguir bem como o algoritmo para urocultura a partir de amostra colhida por punção suprapúbica que pode ser observada na figura 42 Dois prováveis patógenos com sintomas de ITU Identificar o nível da epécie Solicitar nova amostra para confirmação Fazer antibiograma Um provável patógeno Identificar o nível de espécie Se paciente assintomático bacteriúria assintomática Fazer antibiograma Na presença de outras espécies em contagens 104 relatar número de microrganismo Figura 41 Algoritmo para urocultura com contagem de colônias 105 UFCml em amostras colhidas por jato médio 72 Unidade I Um ou dois patógenos identificação e antibiograma Três ou mais patógenos identifique a espécie mantenha cultura por segurança por 72 h Sem crescimento Reexamine após 48 horas Se negativo reporte com não houve crescimento bacteriano NHCB Figura 42 Algoritmo para urocultura em amostras colhidas por punção suprapúbica 413 Laminocultivo sistema comercial O laminocultivo consiste de dois meios de cultura Como os mais utilizados destacamse Cled e MacConkey e outras combinações Método bastante utilizado por laboratórios não necessitando de alça calibrada ou técnica específica de semeadura facilidade no transporte fácil conservação do produto em temperatura ambiente além de permitir a identificação presuntiva de bactérias mais comuns causadoras de infecção do trato urinário como E coli O Uribac é um exemplo de laminocultivo disponível comercialmente pela Probac do Brasil É um sistema prático de laminocultivo indicado para o diagnóstico presuntivo de microrganismos que causam infecções do trato urinário permitindo a identificação direta de E coli microrganismo responsável por 80 a 90 dos casos de infecção urinária adquiridas na comunidade e por pelo menos 50 das adquiridas em hospitais É também a identificação presuntiva de outros microrganismos que também são responsáveis por casos de infecções do trato urinário como Morganella spp Proteus spp e Providencia spp O Uribac possui três tipos de meios no laminocultivo o que permite a identificação presuntiva de alguns microrganismos envolvidos no processo infeccioso Na face larga temos meio CLED e nas faces divididas os meios citrato de Simmons e indol acompanha um frasco de reativo de Kovacs para prova do indol Homogenizar a urina sem centriufugar Imergir o sistema no frasco de urina ou semear com auxilio de ceconete Incubar em estufa bacteriológica 35 1 C por 1824 horas Se negativo e sedimenoscopia positiva para bactérias e leuocócitos reincubar por mais 1824 horas Se positivo identifique espécie e realize antibiograma Figura 43 Fluxograma para urocultura processada em laminocultivo comercial 73 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA O crescimento em meio Cled determina a capacidade do microrganismo em fermentar a lactose Sua face larga permite a contagem aproximada em UFCml presente na amostra a contagem pode ser realizada comparando com o padrão de crescimento demonstrado na figura a seguir 102 103 104 105 106 Figura 44 Lamino cultivo Esquema indicando crescimento bacteriano em meio Cled Como principais desvantagens destacase ser um método semiquantitativo ter uma superfície menor de leitura e a dificuldade em visualizar cultura mista 42 Coprocultura Um grande número de agentes infecciosos distintos pode ser frequentemente relacionado a síndromes diarreicas às quais persistem ainda como um grave se não um dos maiores problemas de saúde pública do Brasil e do mundo Calculase que cerca de mais de um bilhão de casos ocorram anualmente em crianças sobretudo aquelas menores de 5 anos de idade e desses mais de 2 milhões de óbitos As causas mais comumente associadas às diarreias e gastroenterites de uma maneira geral podem ser classificadas como infecciosas e não infecciosas Entre as causas infecciosas mais comuns podemos citar aquelas causadas por bactérias especialmente as pertencentes à família Enterobacteriaceae como Escherichia coli sp Salmonella spp Shigella spp protozoários como Giardia lamblia Entamoeba histolytica vírus como os enterovírus De maneira especial rotavírus e vírus da hepatite A HVA e de forma menos comum os fungos alguns deles produtores de micotoxinas como Aspergillus flavus produtor de aflatoxina As causas para doenças diarreicas de origem não infecciosas estão normalmente relacionadas a quadros alérgicos como doença celíaca intolerância à lactose e casos de envenenamento acidental com remédios produtos de limpeza gasolina entre outros A detecção sobretudo de bactérias em amostras fecais nem sempre é um procedimento simples ainda mais em razão da existência da microbiota intestinal residente a qual configurase com sendo extremamente diversa e complexa A formação dessa microbiota ocorre gradualmente logo após o nascimento desenvolvendose até o primeiro ano de vida e estabelecendose dessa forma por toda a fase adulta podendo ser influenciada por terapias antimicrobianas às quais o indivíduo vier a ser submetido Estimase que cerca de 13 do peso seco da amostra fecal seja constituído por bactérias razão da dificuldade já relatada de se determinar em uma situação de patologia quais entre os 74 Unidade I agentes bacterianos presentes na amostra de fato estariam implicados com o quadro de doença a ser investigado Grande parte dos microrganismos presentes na microbiota intestinal algo em torno de 90 ou mais são bactérias anaeróbias estritas predominantemente pertencente aos gêneros Propionibacterium Bifidobacterium Bacteroides entre outras Discutese amplamente qual seria a dose mínima infectante ou seja contagem mínima de microrganismos para o aparecimento de uma doença eou síndrome diarreica o que se entende é que além da dose mínima e talvez até de forma mais importante os fatores de virulência muitas vezes típicos e característicos de um determinado grupo são os elementos que mais colaboram para o surgimento dos sintomas Muitos microrganismos são produtores de toxinas como é o caso de Aeromonas spp Bacillus cereus Clostridium botulinum Clostridium difficile Escherichia coli enterotoxigênica ETEC e Escherichia coli enterohemorrágica EHEC Staphylococcus aureus e bactérias do gênero Vibrio especialmente Vibrio cholerae Outros apresentam a capacidade de invadir e multiplicarse em tecidos como Campylobacter jejuni Salmonella spp Shigella spp e outros de se aderirem ao epitélio e mucosa intestinal como no caso da EPEC Escherichia coli enteropatogênica clássica Os sintomas bem como sua intensidade variam nos pacientes associandose aos mecanismos de patogenicidade ou seja de virulência empregado pelo microrganismo causador do evento Dessa forma o tempo para início dos sintomas e outros sinais como número de evacuações vômitos febre desidratação presença de sangue eou muco nas fezes pode variar de formas mais simples e até mesmo inaparentes quando de simples processos de aderência ao epitélio eou mucosa até situações mais graves quando de infecção por bactérias cuja produção de toxina é caracterizada por aquelas com potencial neurotóxico A amostra ideal para a realização de coprocultura constituise de cerca de 15 a 2 gramas de fezes preferencialmente colhida na fase inicial do quadro diarreico e antes de a antibioticoterapia ser iniciada Recomendase que a amostra seja mantida em frasco contendo conservante pois isso facilita o processo de organização e execução dos procedimentos laboratoriais que se farão necessários Entre os conservantes mais comuns utilizados na prática laboratorial no que tange ao exame de coprocultura destacase a glicerina tamponada usualmente utilizada quando da pesquisa de Salmonella spp Shigella spp Campylobacter spp e Vibrio spp Outro conservante bastante utilizado por sua praticidade e custo é o meio de CaryBlair conhecido por sua capacidade de conservação de amostras contaminadas por Shigella spp e especialmente por Vibrio spp Nesse caso especificamente amostras de anal swab devem ser mantidas em temperatura ambiente 20 a 25 C De todos os procedimentos descritos atenção especial deve ser dada para a pesquisa de Clostridium spp em que as amostras colhidas obrigatoriamente devem ser mantidas refrigeradas com temperatura entre 28 C por até 12 horas e recomendase a coleta das fezes em frasco sem conservante 75 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Algumas situações decorrentes do processo de coleta eou falha no processo de orientação do paciente podem inviabilizar o processamento do exame entre elas destacamse as amostras colhidas sem conservantes que são mantidas inadvertidamente por período superior a 3 horas em temperatura ambiente amostras colhidas ao longo do dia e misturas em um único frasco coletor fezes líquidas colhidas e enviadas em fraldas muitas vezes contaminadas com amostras de urina Para coleta de amostras utilizando de swab ou ceconete de algodão devese tomar cuidados no sentido de evitar falhas no processo de coleta Nesse sentido devese sempre umedecer a ponta de algodão com solução salina estéril nunca usar géis ou pomadas lubrificantes inserir o ceconete no esfíncter retal fazendo movimentos de rotação e ao retirar o swab verificar se a ponta do algodão apresenta coloração compatível com a presença de fezes recomendase não exceder o tempo de 30 minutos para envio do material ao laboratório e enviálo em meio de transporte adequado 421 Procedimento A bacterioscopia das fezes não é realizada na rotina do laboratório de microbiologia no entanto sabese que eventualmente pode fornecer informações bastante valiosas para a identificação de processos de infecção tais como presença de piócitos e hemácias os quais são indicativos de infecções por microrganismos invasores presença maciça de bactérias Grampositivas para infecções por Staphylococcus aureus e toxinfecções por bacilos encurvados que sugere fortemente infecção por Campylobacter spp eou Vibrio spp Importante ressaltar que as amostras colhidas com conservante não permitem uma visualização perfeita de leucócitos e hemácias no entanto a conservação da amostra para a cultura é prerrogativa do exame Em linhas gerais o sistema de cultura de fezes utiliza inúmeros meios seletivos Agar McConkey diferenciais a fim de aperfeiçoar o processo e garantir o isolamento de microrganismos potencialmente patogênicos mesmo em dose ou carga microbiana considerada baixa Se a amostra a ser analisada corresponde a fezes líquidas elas devem ser semeadas diretamente nos meios indicados no entanto se a amostra se constituir de fezes sólidas ou pastosas sugerese que se prepare uma suspensão em solução contendo 10 de salina tamponada glicerinada e proceda na sequência com a semeadura Os meios mais usualmente utilizados para o procedimento são Ágar McConkey reconhecidamente um dos mais utilizados sendo considerado um meio diferencial pois permite a identificação de fermentação de lactose Nesse modelo as bactérias fermentadoras da lactose promovem a acidificação do meio alterando sua cor e deixandoo com uma cor amarela Ágar SalmonellaShigella SS e ágar Hektoen entérico HE são considerados meios seletivos e recomendados para isolamento de diferentes espécies de Salmonella spp Shigella spp e eventualmente de Vibrio spp e podem ser utilizados um em substituição ao outro apesar de a qualidade do ágar HE ser considerada superior 76 Unidade I Os caldos como tetrationato e o selenito são considerados meios de enriquecimento e devem ser utilizados a fim de promover o crescimento e um perfeito isolamento de microrganismos patogênicos os quais podem estar em pequenas contagens na amostra biológica Interessante ressaltar que ao se inocular amostra de fezes em caldo tetrationato é recomendado que se adicione ao meio de 3 a 5 gotas de solução de iodo homogeneizandoo bem com o objetivo de inibir o crescimento de cocos Grampositivos provenientes da microbiota da pele os quais podem vir a dificultar o isolamento de bactérias patogênicas associadas ao quadro de infecção Meios como AS Campy e ou Karmali devem ser utilizados sempre que há suspeita de infecção por Campylobacter spp Nesse caso devese aguardar uma solicitação específica para tal procedimento Para o isolamento e identificação de enterobactérias enteropatogênicas devese semear a suspensão de fezes simultaneamente em dois sistemas compreendidos por um caldo o qual pode ser tetrationato acrescido de iodo eou selenito e em placas contendo ágar seletivo McConkey mais recomendado eou SalmonellaShigella SS O fluxograma a seguir ilustra a sequência sugerida para a realização do procedimento no qual se acrescenta somente por solicitação médica o procedimento também ilustrado para isolamento de Campylobacter spp O fluxograma para coprocultura desde a escolha dos meios tempos e critérios de diagnóstico também podem ser compreendidos observando o fluxograma apresentado a seguir Coloração com fucsina de Ziehl 01 e provas bioquímicas 4872 h 42 C em microaerofilia usar jarra Ágar AS Campy ou Karmali sob solicitação específica 1824h 35 1 C sorotipagem por técnica de aglutinação Transferência de colônias suspeitas e identificação ao nivel de espécie por provas bioquímicas Caracterização macroscópica de colônias Ágar HE ou SS 1824 h 35 1 C Caldo tetrationato iodo ou caldo selenito 1218 h 35 1 C Suspensão de fezes ou se fezes líquidas semeadas diretamente 1824 h 35 1 C sorotipagem por técnica de aglutinação Transferência de colônias suspeitas e identificação ao nível de espécie por provas bioquímicas Caracterização macroscópica de colônias Ágar MC ou SS 1824 h 35 1 C Meios eou kits comerciais Rugai EPMMili disponíveis Técnica recomendada quando do isolamento de Escherichia coli Salmonella spp Shigella spp Figura 45 Fluxograma de identificação de enterobactérias enteropatogênicas 77 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Para se reportar o resultado de uma coprocultura é importante se atentar que muitas vezes não é possível em função da diversidade de microrganismos isolar e identificar todos os prováveis patógenos presentes em uma amostra por isso a importância de se relatarem todos os agentes que puderam ser pesquisados independentemente do resultado encontrado Devese para tal pesquisa ser feita levar em consideração os agentes etiológicos mais comumente isolados na população devendo ser pesquisados agentes de exposição rara somente quando de situações de surtos eou epidemias 43 Hemocultura A Hemocultura é utilizada para demonstrar a presença de baterias na corrente circulatória O isolamento e identificação rápida de gentes etiológicos de septicemias são procedimentos da maior importância na microbiologia clínica O termo bacteremia representa a presença de microrganismos viáveis disseminandose pela corrente sanguínea o que invariavelmente é indício de grande gravidade pois associase essa disseminação com um alta taxa de morbimortalidade tornando hemocultura um exame fundamental para a elucidação e controle desses casos Grande parte das infecções sépticas tem origem no ambiente hospitalar o que as torna substancialmente mais graves em razão das características em termos de resistência que os microrganismos apresentam A hemocultura nesse contexto é extremamente importante pois além de nortear a antibioticoterapia será de fundamental importância para limitar a infecção inclusive para o ambiente hospitalar As bacteremias em linhas gerais podem ser classificadas em primárias ou secundárias Quando a infecção ocorre a partir do próprio sistema circulatório ou pela entrada através de instrumentos e ou fômites como agulhas cateteres e sondas A bacteremia secundária ocorre como disseminação a partir de outros sítios para a corrente circulatória Elas ainda podem ser classificadas como transitórias intermitentes contínuas ou de escape São consideradas bacteremias transitórias aquelas que ocorrem de maneira rápida com duração variando entre alguns minutos a poucas horas comumente associada a feridas como abcessos furunculoses etc Quando a bacteremia ocorre em intervalos variáveis de tempo mas por um mesmo microrganismo denominamos o quadro de bacteremia intermitente normalmente tal situação ocorre associada à formação de abcessos intraabdominais tais como hepáticos pélvicos e prostáticos A bacteremia descrita como contínua ocorre comumente associada à endocardite infecciosa e a outras complicações vasculares já a bacteremia de escape ocorre em pacientes que estejam fazendo uso de antibioticoterapia em estágio inicial de tratamento em que pode haver uma menor concentração do antibiótico na circulação sanguínea São inúmeros os microrganismos causadores de septicemias Entre os Grampositivos geralmente destacamse Staphylococcus aureus Staphylococcus coagulase negativa Enterococcus spp Streptococcus spp entre os Gramnegativos aqueles pertencentes à família Enterobacteriaceae e os bacilos Gramnegativos não fermentadores como a Pseudomonas aeruginosa e não deixando de citar fungos como Candida spp de maneira particular Candida albicans Apesar da grande variedade de 78 Unidade I microrganismos é comum que as infecções ocorram predominantemente por um único microrganismo apesar de já terem sido relatadas infecções polimicrobianas Uma sepse bacteriana ou fúngica certamente remete a uma falha na capacidade de defesa do organismo do hospedeiro no sentido de localizar neutralizar e eliminar a infecção em seu sítio inicial Importante entender que uma sepse pode ocorrer por inúmeros fatores que não se tratam exclusivamente da possível falha da resposta imune Nesse sentido doenças de base como neoplasias diabetes mellitus e insuficiência renal idade uso de medicamento sobretudo do grupo dos cortiçoesteroides procedimentos médicos como cateterismo pacientes queimados eou com infecções do trato geniturinário são fatores que podem contribuir ou influenciar o surgimento de uma sepse Do ponto de vista ideal a coleta deve ser feita antes de a antibioticoterapia ter sido iniciada em pacientes que apresentem quadro clínico por sinais e sintomas compreendidos por febre maior que 38 C ou hipotermia menor que 36 C leucocitose maior que 10000mm3 ou granulocitopenia absoluta menor que 1000 leucócitosmm3 em crianças pequenas com quadro de apatia no estado geral sem explicação e em idosos principalmente acompanhados de malestar mialgia ou sinais Quanto a pacientes já internados e sob uso de antibioticoterapia e que apresentem sinais de infecção sistêmica proceder com a coleta de hemocultura Preferencialmente colhendo o material antes do início de um novo esquema de dose Para melhor entendimento do processo de coleta entendese que uma amostra de hemocultura corresponde à coleta por uma única punção de dois frascos de sangue para adultos e um frasco para crianças até 13 kg O número mínimo não deve ser inferior a 2 e o máximo de 4 amostras Esse limite é justificado em razão da necessidade de se confirmar um resultado seja ele positivo ou negativo e para tal a análise de uma única amostra poderia deixar dúvidas Objetivamente as amostras são coletadas por punção venosa preferencialmente assim que a temperatura do paciente começa se elevar no entanto vale a ressalva que não se recomenda a coleta durante o pico febril e o uso de antitérmicos não irá interferir no resultado da hemocultura A amostra deve ser colhida de diferentes pontos ou sítios anatômicos em intervalos de 30 minutos cada Tradicionalmente não se utilizam amostras de sangue obtidas de dispositivos como cateteres a não ser que o objetivo seja avaliar o dispositivo em si Nesse caso recomendase que além dessa amostra sejam colhidas outras duas por punção venosa de sítios anatômicos distintos Outra variável importante a ser considerada no procedimento é o volume de amostra a ser colhido Sabese que quanto maior o volume maiores serão as chances de positividade no entanto devese observar a idade e as condições gerais do paciente para não incorrer em um prejuízo maior que os benefícios alcançados com o procedimento Nesse sentido recomendase que para crianças com até 13 kg devese colher de 1 a 4 ml em frasco para cultura de aeróbios excetuandose em lactentes com baixo peso eou dificuldade para colhimento cujo valor a ser colhido pode ser entre 05 e 1 ml em crianças com peso entre 1336 kg devese colher por amostra dois frascos contendo 5 ml cada sendo 79 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA um para cultura de aeróbios e outro para anaeróbios completando um volume total de 10 ml Em crianças eou adultos com peso acima de 36 kg colhese de 510 ml em dois frascos para cultura de bactérias aeróbias e anaeróbias totalizando um volume máximo por amostra de 20 ml Como já descrito são inúmeras as situações que podem demandar a realização de uma hemocultura A seguir recomendações para número de amostras coletadas em razão do quadro clínico apresentado Bacteremiafungemia primária eou secundária Colher de 2 a 3 amostras consecutivas e de sítios distintos Quadro febril indeterminado Colher de 2 a 3 amostras consecutivas e de dítios distintos Se resultados negativos em até 48 h colher mais 2 amostras Suspeita de sepse com hemoculturas negativas Investigar possível infecção por micobactérias fungos e outros microrganismos fastidiosos ex Legionella spp Para um procedimento de coleta adequado a antissepsia é considerada um fator crítico em virtude de uma possível contaminação da amostra caso ela não seja eficientemente executada Para a realização do procedimento o braço do paciente deve estar devidamente garroteado e quanto à veia selecionada dar preferência pelas de maior calibre e mais superficiais Fazer a antissepsia com algodão ou gaze embebida em álcool 70 aplicar uma solução de clorexidina alcoólica a 05 ou solução à base de iodo Nesse caso após a punção remover o excesso com álcool 70 a fim de evitar reações alérgicas tardias Promover a limpeza com movimentos circulares e centrífugos ou seja do centro para a periferia a partir do local elegido para a punção Importante deixar separado todos os frascos que serão utilizados já devidamente etiquetados e identificados para evitar intercorrências durante o procedimento Os frascos colhidos podem ser mantidos a temperatura ambiente por até 12 horas após o procedimento de coleta prazo máximo para que essa amostra possa ser processada com eficiência ressaltandose que o resultado do teste depende em boa parte da coleta e envio eficiente do material ao laboratório 431 Procedimento As metodologias para o processamento das amostras vão desde métodos convencionais ditos manuais a metodologias semiautomatizadas e automatizadas Apesar de pouco indicadas atualmente as metodologias manuais ainda são muito utilizadas e os laboratórios de pequeno ou médio porte que em sua maioria ainda as utilizam buscaram uma forma de tornar o procedimento mais eficiente utilizandose de meios de culturas comerciais tanto para microrganismos aeróbios como anaeróbios como o caldo meio líquido de infusão cérebrocoração BHI ou caldo caseína 80 Unidade I digerida de soja TSB Ambos podem ser utilizados para pesquisa de aeróbios e caldo columbia para anaeróbios e fastidiosos O sistema Hemobac Trifásico ProbacR é a metodologia semiautomatizada mais utilizada É um laminocultivo contendo duas fases Na parte inferior um recipiente plástico contendo caldo suplementado com extrato de levedura caldo de enriquecimento é acoplado à parte superior que contém as faces do laminocultivo o qual é composto de ágar chocolate ágar Sabouraud leveduras e ágar McConkey Os frascos são incubados em estufa própria que possibilita sua inversão periódica procedimento importante para a evolução do isolamento A bacterioscopia e o antibiograma são realizados a partir das colônias isoladas Sem dúvidas os métodos automatizados trouxeram um grande avanço e uma melhoria considerável dos procedimentos em hemocultura Tais procedimentos permitem um contínuo monitoramento uma maior sensibilidade compreendida pelo aumento na positividade da amostra menor risco de contaminação interfaceamento dos resultados entre as unidades laboratoriais envolvidas rapidez na liberação do resultados negativos e positividade muitas vezes em até 48 horas do início do procedimento menor necessidade de repetição da amostra ou repique do material Nesse sentido existem atualmente diversos equipamentos e representantes que atendem a essa demanda tal como Bactec modelos FX série 9000 9050 91209240 ou MGIT becton dickinson diagnostic instrument systems e BacTALERT 3D 60120240 BioMerieux todos tendo como princípio os métodos de detecção estabelecidos por fluorescência ou colorimetria Os meios comerciais não requerem uso de amostras padrão ou de controle de qualidade no entanto é importante que o fabricante envie a certificação dos testes de qualidade realizados juntamente como os meios e sistemas de cultura A coloração de Gram deve ser considerada dentro do contexto das hemoculturas uma informação descritiva de máxima relevância em razão das características morfotintoriais que essa coloração possibilita relatar Para pacientes acometidos por infecções sistêmicas tal informação é de extrema relevância pois permite ao clínico o escalonamento de antimicrobianos em um processo que denominado de antibioticoterapia primária e o resultado da cultura a posteriori pode indicar a manutenção da antibioticoterapia iniciada ou seu reescalonamento e início de uma antibioticoterapia direcionada para o resultado da cultura Diante disso se houver crescimento de microrganismos após qualquer período de incubação emitir resultado parcial com base na bacterioscopia prosseguir para a identificação do microrganismo em termos de gênero e espécie e fornecer o antibiograma Se o resultado for negativo ele deve ser emitido informando por escrito a negatividade após as horas decorridas desde a incubação Alternativamente quando de amostras persistentemente negativas devese avaliar as suspeitas clínicas e recomendar a pesquisa de fungos eou de agentes fastidiosos como Legionella spp Brucella spp Haemophilus spp Kingella spp Bordetella spp entre outras 81 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA A seguir apresentase um fluxograma proposto para a análise e processamento de material para hemocultura Desprezar frasco Se suspeitar de fungo incubar 30 C 10 dias Manter frascos em estufa 35 1 C jarra de CO2 até completar 7 dias Manter frascos em estufa 35 1 C até completar 48h Negativo Negativo Negativo Emitir resultado parcial Emitir resultado parcial Emitir resultado parcial Semear em ágar sangue e bacterioscopia Semear em ágar sangue e bacterioscopia Incubar 35 1 C 24 h Frasco de hemocultura Identificação em termos de espécie e antibiograma Identificação em termos de espécie e antibiograma Identificação em termos de espécie e antibiograma Positivo Positivo Positivo Semear em ágar chocolate Figura 46 Fluxograma para hemoculturas resultados preliminares devem ser emitidos a cada 24 horas Saiba mais A maioria dos episódios sépticos tem origem hospitalar e com certa frequência envolvem microrganismos que apresentam grande resistência aos antimicrobianos estando associados a taxas de mortalidade com tendência a serem superiores às dos episódios que ocorrem na comunidade Nesse contexto o laboratório clínico tem um papel extremamente importante no manejo de pacientes com bacteremia Para saber mais sobre hemocultura leia ARAÚJO M Hemocultura recomendações de coleta processamento e interpretação dos resultados Journal of Infection Control v1 n 1 2012 Disponível em httpsbitly3ha1WEZ Acesso em 1º jul 2021 82 Unidade I 44 Culturas de secreções e feridas 441 Cultura de secreção prostática vaginal cervical e uretral Inúmeros fatores podem ser associados ao incremento das infecções genitais em nossa população os fatores associamse tanto às características intrínsecas dos microrganismos mais fortemente associados a esses processos como também às características socioeconômicas culturais e comportamentais do hospedeiro Do ponto de vista microbiano sabese que a resistência cada vez mais acentuada aos antibióticos bem como a sua variação antigênica contribuem fortemente para o aumento do número de infecções Em relação ao hospedeiro percebese que o aumento do número de parceiros sexuais aumenta as chances de se contrair doenças como sífilis e gonorreia em uma proporção que chega a ser vinte vezes maior em homens que apresentam mais de quatro parceiras sexuais em comparação com aqueles com apenas uma parceira Os tratos genitais masculinos e femininos podem abrigar diferentes grupos microbianos os quais podem invariavelmente ser associados a inúmeros quadros de infecção os quais podem variar de quadros de vaginitevaginose a situações como epididimite e prostatite Os agentes microbianos mais importantes por sua alta incidência e pela variedade de processos aos quais podem estar associados são Neisseria gonorrhoeae associada a infecções como cervicite uretrite e epididimite Chlamydia trachomatis associada a quadros com doença inflamatória pélvica bartolinite algumas enterobactérias estafilococos e estreptococos associados a quadros de prostatite entre outros Muitas dessas infecções podem ser consideradas sexualmente transmissíveis o que as torna de extrema relevância para saúde pública Podese citar como exemplo o cancro mole infecção causada pelo Haemophilus ducreyi uma bactéria fastidiosa capaz de provocar a formação de lesões ulcerativas profundas sensíveis e bastante dolorosas Treponema pallidum causadora da sífilis uma doença de extrema relevância por apresentar três fases distintas reconhecidas como sífilis primária secundária e terciária que pode acometer o sistema nervoso central SNC levando ao óbito e em gestantes chega ao ponto de prejudicar a formação fetal ou provocar abortos o Streptococcus agalactiae também conhecido como estreptococo betahemolítico do grupo B de Lancefield encontrado em cerca de 50 das mulheres sexualmente ativas e em 1040 das gestantes constitui a principal causa de septicemia neonatal Todos esses configuram como agentes de doenças que merecem ser melhor compreendidas estudadas e avaliadas As infecções do trato genital podem não permanecer restritas a ele e acabar por evoluir para situações mais graves causando complicações cardíacas como endocardites osteoarticulares como no caso de artrites renais como pielonefrites cistites e até mesmo do SNC como meningites e encefalites Em razão da diversidade de materiais inúmeros são os procedimentos que podem ser realizados Os mais comuns são os provenientes de secreção vaginal cervical uretral e prostática De maneira geral 83 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA o material clínico é coletado por meio de swabs vaginal cervical endocervical e uretral ou por exame de urina ou de massagem prostática método de Meares e Stamey nas suspeitas de prostatite Na maioria dos materiais coletados o procedimento inicial é o exame direto ou bacterioscopia pela coloração de Gram O esfregaço deve ser preparado rolandose o swab sob a lâmina ou gotejando o material clínico colhido sobre a lâmina No caso de secreção vaginal eou cervical devese após a inserção do especulo retirar o excesso de muco presente na região cervical com um swab de algodão inserilo pelo canal vaginal colhendo a amostra do fundo de saco e da parede vaginal Além da amostra para cultura colher uma amostra em solução fisiológica estéril para a eventual pesquisa sob solicitação de Trichomonas vaginalis e leveduras Para a pesquisa de Streptococcus agalactiae recomendase a coleta de amostra vaginal e anorretal concomitantemente No exame microscópico de secreções vaginais de uma maneira geral devese observar a presença de microrganismos descrevendo suas características morfotintoriais presença de piócitos se numerosos eou raros presença ou ausência de muco presença ou ausência de células epiteliais eou de descamação No caso de secreção uretral devese sempre iniciar o processo retirandose o excesso de material secretivo eventualmente presente no meato uretral introduzir o swab uretral 24 cm no lúmen uretral rotativamente e depois colocálo em meio de transporte Stuart Devese da mesma forma como na secreção vaginal proceder com uma amostra para bacterioscopia e uma amostra em solução fisiológica estéril para a pesquisa de fungos e protozoários como o Trichomonas A coleta de secreção prostática deve ser realizada implementandose em conjunto a técnica de Meares e Stamey a qual é reconhecidamente útil no diagnóstico dos casos de prostatite crônica e de infecções do trato urinário de repetição Nessa técnica colhemse duas amostras de urina conhecidas como amostra de primeiro e segundo jato interrompese a micção procedese com a massagem prostática e colhese na sequência uma amostra de secreção prostática e uma amostra de urina pósmassagem denominada de urina primeiro jato pósmassagem prostática O resultado da coloração de Gram deve ser sempre considerado quando da avaliação das culturas realizadas independentemente da solicitação do clínico A análise bacterioscópica fornece informações substanciais no processo de identificação dos agentes associados aos processos patogênicos revelando informações muitas vezes bastante próprias de cada grupo bacteriano envolvido como forma cor aspecto entre outros A título de exemplificação podese citar as características típicas de N gonorrhoeae as quais se revelam em ágar chocolate como colônias pequenas brilhantes e convexas 84 Unidade I Importante sempre que possível que se possa estabelecer o número e tipos de elementos encontrados nas amostras analisadas com os microrganismos isolados em cultura como a presença de cluecells nome fornecido às células de característica escamosa nas quais notase uma grande presença de cocobacilos aderidos típica de infecção por Gardnerella vaginalis Outro exemplo típico é a associação que se estabelece entre a presença de numerosos leucócitos na amostra com a infecção por Trichomonas vaginalis Nos casos de secreção vaginal e cervical os processos melhor esclarecidos do ponto de vista etiológico são aqueles causados por Candida albicans e Trichomonas vaginalis entretanto atualmente temse verificado elevada frequência de infecção por G vaginalis normalmente em associação com bactérias anaeróbias Outras espécies bacterianas particularmente os membros da família Enterobacteriaceae raramente são consideradas patógenos causadores de vaginites eou vaginoses Para a bacterioscopia preparar o esfregaço como o material colhido deixar secar em temperatura ambiente e fixar sob a ação da chama do bico de Bunsen corar pela técnica de Gram Relatar a presença de piócitos se raros frequentes ou numerosos presença de bacilos de Doderlein típicos da microbiota vaginal normal presença de leveduras em brotamento ou na formação de pseudohifas a qual é indicador de infecção por Candida albicans Verificar a presença de cluecells típicas de infecção por G vaginalis e por Trichomonas vaginalis facilmente visualizadas pela coloração de Gram Para a pesquisa de G vaginalis colher 3 swabs e avaliar o pH vaginal com fita reativa Com o primeiro swab preparar lâmina para bacterioscopia corando o esfregaço pela coloração de Gram em que se irá avaliar a presença de cluecells Com o segundo swab fazer o teste do odor imergindoo em um tubo contendo KOH a 10 verificar a liberação de odor fétido Com o terceiro swab semear em ágar sangue em anaerobiose por período entre 2448 horas e se crescimento positivo partir para as provas de identificação confirmatórias Se resultados negativos para Gardnerella vaginalis investigar outros possíveis patógenos Tais como Haemophilus ducreyi se houver presença de lesão N gonorrhoeae Estreptococos do grupo B de Lancefield e Candida spp Para a pesquisa de candidíase vaginal sobretudo em situações de vulvovaginites tipicamente caracterizadas por irritação prurido intenso e corrimento vaginal recomendase a bacterioscopia por coloração de Gram em que se revelará a presença de células leveduriformes Grampositivas com formação de pseudohifas Devese proceder o cultivo semeando a amostra em ágar Sabouraud a 36 1 C durante 2448 horas Após esse período se a cultura for positiva se notará a presença de colônias grandes brancas de aspecto mucoide as quais para confirmação em nível de espécie exigemse provas bioquímicas específicas A figura seguinte apresenta um fluxograma sugerido para processamento análise e interpretação de cultura e bacterioscopia de secreção vaginalcervical As figuras 57 e 58 apresentam respectivamente um fluxograma para processamento de amostra de secreção uretral e de amostra de urina e um fluxograma para processamento de amostra de secreção prostática e de amostra de esperma obtida por manipulação direta 85 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Secreção vaginal e cervical 1 swab bacterioscopia cluecells Trichomonas elementos celulares Colher 3 swabs 2 swab teste do odor em solução de KOH Positivo para G vaginalis se odor fétido peixe 3 swab Semear ágar sangue ThayerMartin e TOODVA 2448 h 36 1 C identificação em nível de espécie Figura 47 Fluxograma para processamento análise e interpretação de cultura e bacterioscopia de secreção vaginalcervical Semeadura com alça calibrada de 001 mL em ASTM 24 48 h 35 1C Identificação em nível de espécie Bacterioscopia por técnica de Gram exame direto Bacterioscopia por técnica de Gram Amostra obtida por manipulação direta esperma massagem prostática ou técnica de Meares e Stamey Figura 48 Fluxograma para processamento de amostra de secreção uretral e de amostra de urina Semeadura com alça calibrada de 001 ml em ASTM 24 48 h 35 1 C Identificação em nível de espécie Bacterioscopia por técnica de Gram exame direto Bacterioscopia por técnica de Gram Amostra obtida por manipulação direta esperma massagem prostática ou técnica de Meares e Stamey Figura 49 Fluxograma para processamento de amostra de secreção prostática e de amostra de esperma obtida por manipulação direta 442 Cultura de secreções de oro e nasofaringe A maioria das infecções de orofaringe são de origem virótica variando entre 5 e 10 em pacientes adultos e de 15 a 20 em crianças em casos associados a bactérias Tipicamente as infecções bacterianas apresentamse com características bastantes secretivas de coloração amareloacinzentadas sob o palato tonsilas e faringe São inúmeros os agentes bacterianos associados entre os quais destacamse Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus Neisseria meningitidis Corynebacterium diphtheriae Haemophilus 86 Unidade I influenzae Moraxella catarrhalis Streptococcus pneumoniae e entre os fungos destaque especial para Candida albicans Tais microrganismos frequentemente estão associados a quadros de infecção como faringite tonsilite sinusites entre outras Para a coleta de secreção orofaríngea recomendase a utilização de abaixadores de língua e o uso de swab o qual deve ser rolado por sobre as tonsilas e faringe posterior de maneira especial sobre as áreas edemaciadas e hiperemiadas quando de sua existência Amostras de swabs nasais ou de nasofaringe devem ser obtidas introduzindo o swab nas narinas e fazendo movimentos rotatórios por aproximadamente 15 segundos restrito às narinas ou introduzindo até a nasofaringe respectivamente Na análise de secreção de oro e nasofaringe a bacterioscopia tem pouco valor diagnóstico em virtude da intensa microbiota oral no entanto esse exame pode sugerir infecção por Fusobacterium spp normalmente associado à angina de Vincent uma gengivite ulcerativa necrosante aguda Guna a qual normalmente não envolve o acometimento de outros tecidos da área periodontal caso ocorra tal envolvimento a doença passa a ser conhecida como periodontite ulcerativa necrosante Semeadura ASCHOC 24 48 h 35 1 C jarra de anaerobiose Coleta da amostra com swab Identificação em nível de espécie Bacterioscopia por técnica de Gram Bacterioscopia por técnica de Gram exame direto Angina de Vincent Guna Numerosos leucócitos PMNs espiroquetas eou bacilos fusiformes Figura 50 Fluxograma para processamento de amostra de secreção de oro e nasofaringe 443 Cultura de escarro Exsudatos brônquicos e pulmonares são estudados quase sempre por meio de exame de escarro Há inúmeras dificuldades na execução desses exames em virtude da contaminação quase sempre inevitável por microrganismos pertencentes à microbiota oral e salivar A presença de numerosas células de descamação sugere a contaminação por saliva A amostra de escarro normalmente é solicitada quando da suspeita de pneumonias bacterianas as quais têm como agentes etiológicos mais comuns o Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Mycoplasma pneumoniae entre outros Nos casos suspeitos de tuberculose e nas infecções fúngicas causadoras de infecções pulmonares como histoplasmose paracoccidioidomicose e aspergilose por exemplo devese sempre proceder à coloração de ZiehlNeelsen e exame a fresco para pesquisa de fungos 87 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Identificação em nível de espécie Bacterioscopia por técnica de Gram Bacilos alongados tortuosos indicativo de infecção por M tuberculosis Confirmação por cultura em meio de LowesteinJensen lab de referência Semeadura ASCHOC e MC 2448 h 35 1 C jarra de anaerobiose Coleta escarro esforço de tosse Bacterioscopia Vaciloscopia por técnica de ZiehlNeelsen e pesquisa de fungos exame direto Positivo para presença de fungos Cultura em meio de ágar Sabouraud identificação em termos de espécie Figura 51 Fluxograma para identificação de patógenos em amostras de escarro 444 Cultura de aspirado traqueal lavado bronco alveolar BAL e escovado brônquico Para a cultura de aspirado traqueal devese utilizar a técnica da diluição seriada e é altamente recomendada a utilização de agentes mucolíticos a fim de facilitar o resgate de patógenos presentes na amostra Entre os agentes mucolíticos mais utilizados destacase a NacetilLcisteína a 1 utilizada antes de se proceder com as diluições recomendadas Amostras de lavado broncoalveolar bem como de escovado brônquico podem ser processadas utilizando da mesma metodologia para a cultura de aspirado variando apenas em termos de quantidade de amostra e da diluição empregada Na bacterioscopia a microbiota presente nesse material costuma reproduzir exatamente o processo infeccioso das vias respiratórias inferiores como descrito anteriormente para a cultura de escarro A bacterioscopia eou baciloscopia devem ser feitas seguindo os mesmos critérios e cuidados O aspirado traqueal normalmente é obtido de pacientes internos em unidade hospitalar muitas vezes de unidades de terapia intensiva e sob uso contínuo de aparelhos artificiais de respiração Para se colher o material devese aspirar o conteúdo com instrumental adequado e a amostra ser preservada em tubo estéril Em razão da diversidade de microrganismos que podem estar presentes na microbiota oral o resultado da cultura de aspirado BAL e ou escovado obrigatoriamente passa pela necessidade de ser quantificado Para tal devese levar em consideração a quantidade de placas semeadas e multiplicarse o número de microrganismos contados colônias pelo fator da diluição No caso de amostras de BAL eou escovado nas placas semeadas a partir da diluição 11000 uma colônia bacteriana equivale a 103 UFCml em placas semeadas com alça calibrada de 001 ml ou de 0001 ml respectivamente uma colônia equivale a 100 ou 102 UFCml ou uma colônia equivale a 1000 ou 103 UFCml No caso de aspirado traqueal sendo o material semeado com alça calibrada de 0001 ml uma colônia equivale a 20000 bactérias ou 2x104 UFCml 88 Unidade I Se os valores encontrados forem iguais ou superiores aos citados obrigatoriamente devese proceder com a identificação em nível de espécie e com o antibiograma para início da terapia antibacteriana específica Diluir 1 2 com agente mucolítico se aspirado Confirmação por cultura em meio de LowesteinJensen lab de referência Bacilos alongados tortuosos indicativo de infecção por M tuberculosis Coleta do aspirado BAL ou escovado Bacterioscopia Baciloscopia por Técnica de ZiehlNeelsen e pesquisa de fungos exame direto Cultura em meio de ágar Sabouraud identificação em termos de espécie Positivo para presença de fungos Semear 001 mL em AS CHOC e MC 35 1 C 2448 h jarra de anaerobiose Bacterioscopia e identificação em nível de espécie Diluir 01 mL em 99 ml de solução fisiológia estéril Para amostras de BAL ou de escovado diluir 01 ml de amostra em 09 ml de solução fisiológica estéril 110 semear dessa diluição 001 ml nas placas recomendadas Figura 52 Fluxograma para processamento de amostra de aspirado BAL e escovado brônquico 445 Cultura de secreção ocular e de ouvido O material supurativo do olho infectado deve ser colhido do fundo do saco inferior ou do canto interno Associase tal solicitação com a suspeita de infecções oculares como as conjuntivites cujos agentes bacterianos mais comuns são o Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Haemophilus spp Pseudomonas spp Neisseria gonorrhoeae sobretudo em recémnascidos e Chlamydia trachomatis Para diagnóstico de infecção por Chlamydia trachomatis é altamente recomendável que se faça o raspado da conjuntiva e a amostra seja submetida ao teste de imunofluorescência direta ou à pesquisa de inclusões citoplasmáticas com a utilização de solução de lugol ou de solução contendo 5 de iodo e 10 de iodeto de potássio As culturas de material do canal auditivo externo geralmente não refletem a causa bacteriana de uma otite média a menos que tenha ocorrido ruptura da membrana timpânica Os principais agentes associados à infecção são Streptococcus pyogenes e Haemophilus spp As amostras devem ser semeadas em AS CHOC e caldoTHIO tioglicolato e mantidas a 35 1 C em jarra de anaerobiose por 24 horas período após o qual se as placas forem positivas as colônias deverão ser identificadas e deverá se realizar o antibiograma Se negativas as placas devem ser reincubadas e acompanhadas por mais 48 horas sendo avaliadas a cada 24 horas O caldo tioglicolato deve ser utilizado quando nas primeiras 24 horas de incubação não houver crescimento em placas Nesse caso 89 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA semeiase a partir do caldo e se positivo procedese com a identificação e antibiograma Se negativo aguardamse as mesmas 48 horas para finalizar o procedimento e reportar o resultado como negativo 45 Cultura de ponta de catéter Os catéteres venosos centrais de longa duração ou permanência são utilizados quando da necessidade contínua e portanto prolongada de acesso ao sistema vascular isto é prática comum em pacientes que clinicamente necessitem desse dispositivo para hemodiálise hemoterapia quimioterapia e nutrição parenteral prolongada Tais dispositivos podem ser produzidos em material de silicone ou poliuretano Pacientes imunossuprimidos como no caso daqueles em tratamento quimioterápico apresentam um aumento significativo de infecções associadas ao uso do dispositivo o que acaba por favorecer uma elevação dos níveis de morbimortalidade com riscos e agravos adicionais A infecção é a complicação mais importante associada ao uso de catéteres Epidemiologicamente a infecção ocorre em cerca de 19 dos pacientes em uso desse dispositivo dessas 7 são caracterizadas como infecções locais e em 12 são responsáveis por quadros de bacteremia associada ao catéter As infecções normalmente associadas a catéter vêm acompanhadas de sinais e sintomas locais bastante característicos como edema ou inchaço local eritema presença de material secretivo pus com ou sem a presença de febre A bacteremia relacionada ao catéter é confirmada pela presença de sintomas como febre eou calafrios em pacientes com catéter venoso central sem outro foco infeccioso aparente Nesses casos a conduta adequada exige que o paciente seja submetido à coleta de hemoculturas as quais devem ser colhidas tanto de pontos periféricos quanto do próprio catéter Entre as técnicas de investigação de catéteres existentes destacase a técnica de Maki a qual considera valores positivos quando há mais de 15 UFCplaca de determinado microrganismo As infecções do sítio de inserção dos acessos vasculares geralmente são de menor importância e gravidade se comparadas àquelas que ocorrem diretamente na corrente sanguínea No entanto tais infecções conduzem a duas reflexões bastante significativas a primeira indica uma necessidade óbvia de intervenção preventiva e específica a segunda utiliza tal processo infeccioso como indicador de qualidade da assistênciaatendimento Entre os agentes infecciosos normalmente associados a infecções em catéteres periféricos os quais invariavelmente estão fortemente associados a bacteremias destacamse as bactérias do gênero Staphylococcus spp precisamente S aureus e Staphylococcus coagulase negativos SCoN que por muito tempo foram consideradas unicamente contaminantes de amostras e atualmente estão fortemente associadas a bacteremias bactérias da família Enterobacteriaceae bacilos Gramnegativos não fermentadores como Pseudomonas spp e fungos como do gênero Candida spp Para se retirar o catéter a fim de avaliar possível sítio de infecção os cuidados para sua retirada são tão importantes quanto aqueles adotados quando de sua inserção Inicialmente devese proceder com 90 Unidade I uma antissepsia perfeita na pele ao entorno do catéter tal procedimento deve ser feito utilizandose de solução iodada de clorexidina Depois retirase o catéter e a porção distal dele parte que estava inserida na veia do paciente é cortada com o auxílio de tesoura e pinças estéreis o tamanho do fragmento deve ser de aproximadamente 5 cm A ponta de catéter colhida é então colocada em tubo ou frasco seco e estéril notase que para tal processo a amostra não deve ser transportada em meios de cultura eou caldos de enriquecimento bem como meios de transporte a fim de evitar a proliferação de possíveis microrganismos provenientes da microbiota da pele ou que tenham iniciado a formação de biofilmes sobre o material do cateter e enviada ao laboratório preferencialmente em um prazo não superior a uma hora desde sua coleta para que possa assim que entregue ser imediatamente processada O método mais empregado para a avaliação de infecção em ponta de cateter é conhecido como técnica de Maki Nessa técnica o fragmento de cateter 5 cm retirado da porção distal a qual encontravase inserida no paciente é rolado por sobre a superfície de uma placa contendo meio de ágar sangue com o auxílio de uma pinça estéril Importante lembrar que apesar de parecer mais simples devese evitar a todo custo esfregar o cateter na placa Na sequência a placa deve ser colocada em estufa por 1824 horas a 35 1 C preferencialmente em jarra de anaerobiose Depois desse período as colônias devem ser contadas e crescimentos iguais ou superiores a 15 UFC por placa são considerados positivos Placas que não apresentarem crescimento nas primeiras 24 horas devem ser acompanhadas por 4872 horas para confirmação do resultado Em todos os casos positivos independentemente do microrganismo isolado devese proceder ao antibiograma Algumas observações são importantes na análise dos resultados Inicialmente devese sempre reportar a contagem de microrganismos mesmo que eles se apresentem em números inferiores a 15 UFC Portanto devese relatar que de acordo com a técnica de Maki valores significativos são considerados acima de 15 UFC cujo esquema foi representado na figura seguinte e protocolo de cultura representado no fluxograma a seguir Estar atento a culturas aparentemente negativas mas que podem estar contaminadas por microrganismos de crescimento lento Em alguns casos a técnica de Maki não permite o isolamento de tais microrganismos Recomendase a coleta de hemocultura em paralelo com a cultura de cateter para melhor elucidação dos casos suspeitos de bacteremia Cateter Ágar sangue Figura 53 Representação da técnica de Maki a ilustração demonstra a aplicação do cateter na superfície da placa de ágar sangue e o processo de rolamento preconizado 91 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Ponta de cateter Técnica de Maki 35 1 C em jarra de anaerobiose por 1824 h Crescimento de colônias positivo Crescimento de colônias negativo reportar negativo após 72 h Contagem identificação em nível de espécie e antibiograma Crescimento de colônias positivo Contagem identificação em nível de espécie e antibiograma Crescimento de colônias negativo Reincubar por mais 2448 h Figura 54 Fluxograma para processamento de amostra de ponta de cateter 46 Culturas de liquor e de líquidos especiais Infecções no SNC são reconhecidamente perigosas e inspiram grande preocupação muitas delas têm elevadas taxas de morbimortalidade Os processos infecciosos que atingem o SNC podem ser causadas por diferentes grupos etiológicos desde bactérias a vírus fungos e protozoários Os processos infecciosos podem ocorrer por meio da via hematogênica ou seja pela circulação sanguínea normalmente a principal via de infecção por via direta através de situações que envolvam trauma direto ao SNC como nos casos de acidentes eou procedimentos cirúrgicos por situações de contiguidade através dos espaços retroperitoneais por exemplo e ainda por invasão de vírus disseminados por nervos periféricos As infecções podem variar desde quadros de meningite aguda ou crônica a situações como encefalite empiemas a abscessos e expõem significativamente o paciente a risco de óbito ou de sequelas permanentes Como principais agentes bacterianos causadores de meningite aguda destacamse S pneumoniae H influenzae e N meningitidis Mycobacterium tuberculosis pode ser considerada causa de meningite aguda e crônica assim como o Treponema pallidum bactéria causadora da sífilis outros agentes fúngicos como Cryptococcus spp Candida spp Histoplasma capsulatum também podem ser associados a processos tanto agudos quanto crônicos Associados a quadros de encefalite destacamse vírus como o Citomegalovirus CMV vírus do sarampo Herpes simplex virus dos tipos 1 e 2 HSV e Enterovirus Protozoários como Naegleria spp Acanthamoeba sp Toxoplasma gondii também são associados com certa frequência epidemiológica a quadros de encefalite Epidemiologicamente algumas doenças se manifestam de maneira sazonal ou seja são influenciadas por clima e em outras muitas vezes influenciadas pelo fator idade e porcentagem de fatores de exposição No caso das meningites ditas comunitárias é muito comum a relação entre a frequência de infecção específica por faixa etária Nesse sentido no período neonatal é bastante comum que ocorram quadros de meningite por bactérias como S agalactiae Escherichia coli e Listeria monocytogenes Em menores de 2 anos notase o predomínio de infecções por S pneumoniae e por 92 Unidade I N meningitidis A partir dos 2 anos de idade até início da fase adulta ou seja próximo dos 18 anos percebese o aumento de casos de infecção das meninges associadas quase que exclusivamente a N meningitidis e a partir dessa idade o predomínio absoluto da infecção é por S pneumoniae A infecção por H influenzae reduziu significativamente após a introdução da vacinação compulsória sendo que alguns estudos sugerem redução variando de 9496 e a infecção por Cryptococcus neoformans em pacientes imunodeprimidos sobretudo aqueles infectados pelo vírus da imunodeficiência humana HIV ainda constitui uma grande preocupação O exame microbiológico do LCR em pacientes sob suspeita clínica de apresentarem quadros de meningites ou encefalites é um dos procedimentos mais urgentes dentro da rotina do laboratório hospitalar em virtude da magnitude que tais processos podem alcançar se não forem diagnosticados e tratados rápida e eficientemente O LCR deve ser colhido preferencialmente por punção lombar ou de reservatório de próteses e por equipe médica responsável É uma convenção e uma necessidade que se colha três amostras em três tubos estéreis sempre que possível Tais amostras são utilizadas para uma melhor interpretação do quadro clínico Das três amostras colhidas uma é destinada a exames de bioquímica e de sorologia outra à microbiologia e a terceira à citologia É altamente recomendável que se colha uma amostra de sangue venoso concomitante com a punção lombar para que se possa avaliar os níveis glicêmicos e comparálos com os níveis de glicorraquia sabese que infecções meníngeas de origem bacteriana comumente costumam causar depleção dos níveis de glicorraquia o que normalmente não ocorre nas infecções virais Outro parâmetro bastante importante é a observação da presença de infiltrado leucocitário e a presença de hemácias na amostra de liquor cujo valor de referência para esses elementos é a ausência Assim sua presença indica claramente processo infecciosoinflamatório com possibilidade de rompimento de barreira hematoencefálica 461 Processamento da amostra e análise dos resultados da cultura de LCR Uma vez enviada a amostra correspondente ao laboratório de microbiologia a amostra de liquor deve ser observada Se ela apresentarse límpida e com volume superior a 1 ml deve ser centrifugada a 3000 rpm por aproximadamente 15 minutos Depois separase sobrenadante de sedimento Do sobrenadante realizase prova do látex a qual indica se positivo processo inflamatório agudo e do sedimento realizamse microscopia e cultura Se a amostra de liquor colhida apresentarse turva ou com volume igual ou inferior a 1 ml proceder diretamente sem centrifugar a amostra 93 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Liquor límpido volume superior a 1 ml Centrifugar a amostra 15 min 3000 rpm Sobrenadante realizar prova do látex Cultura AS e CHOC 35 1 C em anaerobiose por 24 h Coleta de liquor tubo seco estéril Liquor turvo eou com volume inferior a 1 ml Mircoscopia GramZiehlNeelsen tinta da China Cultura AS e CHOC 35 1 C em anaerobiose por 24 h Se negativo reincubar por até 72 h e fornecer resultados parciais Se negativo reincubar por até 72 h e fornecer resultados parciais Sedimento microscopia GramZiehlNeelsen e tinta da China Se positivo identficação em nível de espécie e antibiograma Se positivo identficação em nível de espécie e antibiograma Figura 55 Fluxograma para processamento de amostras de LCR A microscopia a que nos referimos é a técnica de Gram de ZiehlNeelsen para bacilos álcoolácido resistentes Baar como Mycobacterium tuberculosis e a de tinta da China especialmente utilizada para diagnóstico de infecção por C neoformans levedura considerada causadora oportunista de meningite identificada por uma cápsula que a reveste a qual não se cora pelo corante empregado É de fundamental importância que se realize a hemocultura nos casos mais graves pois a bacteremia é demonstrável em até 50 dos casos de meningite pelo meningococo ou pneumococo 462 Coleta processamento e análise da cultura de fluidos biológicos São considerados fluidos biológicos especiais o líquido pleural peritoneal ascítico pericárdico sinovial e a medula óssea Todos indistintamente podem ser sítios de infecção para bactérias e outros agentes infecciosos São todos conhecidos por serem fluidos estéreis que revestem banham e protegem os órgãos e tecidos das cavidades e áreas com as quais se relacionam Por serem áreas desprovidas de microbiota a presença de qualquer número eou espécie de microrganismos deve ser tratada como patogênica e portanto requer imediata avaliação tipificação e tratamento Para a coleta de tais materiais em linhas gerais preconizase a antissepsia com álcool 70 e com solução de iodo a qual sempre deve ser removida ao término de qualquer procedimento evitando como dito anteriormente processos alérgicos e até mesmo situações de queimadura A coleta da amostra deve ser feita por meio de punção percutânea ou de procedimento cirúrgico específico ressaltando que quanto maior o volume de amostra colhida e processada maior a possibilidade de isolamento e identificação do possível microrganismo associado A amostra deve ser colhida em tubo seco e estéril e assim que colhida enviada imediatamente ao laboratório com a solicitação precisa de que tipo de cultura se deseja fazer 94 Unidade I Tal recomendação se justifica em razão de as infecções associada a tais líquidos serem inúmeras destacandose situações de pericardite artrite séptica peritonite etc nas quais associamse diferentes microrganismos como Staphylococcus aureus Acinetobacter sp Mycoplasma pneumoniae Enterobactérias e outros Gramnegativos bactérias anaeróbias como Propionibacterium spp entre outros o que torna todo processo de identificação bastante complexo e diversificado Em linhas gerais a amostra é colhida e centrifugada a 3000 rpm por aproximadamente 15 minutos semelhante ao procedimento descrito para amostra de LCR Com o material centrifugado a amostra deve ser semeada preferencialmente em ágar sangue e chocolate e proceder simultaneamente com a bacterioscopia direta da amostra As placas devem ser incubadas por 24 h a 35 1 C em jarra de anaerobiose Se positivas devese proceder com a identificação em nível de espécie e antibiograma se negativas as placas devem ser reincubadas até completar 72 horas e se negativas novamente reportar o resultado Alternativamente podese fornecer resultados parciais a cada 24 horas para melhor conduta clínica Resumo Foram abordados os principais equipamentos e materiais necessários à pratica da microbiologia clínica e reconhecida a importância das diferentes formas de se semear um material biológico otimizando não somente o procedimento mas facilitando a padronização dos métodos e reprodutibilidade dos ensaios Reconheceuse a importância da automação percebendo sua aplicabilidade e facilidade para a obtenção de resultados mas o papel do profissional de laboratório será ainda maior à medida que dependerá dele estabelecer os critérios de análises da automação em questão e ainda saber interpretar os resultados por ela fornecidos Abordaramse os diferentes métodos aplicados ao diagnóstico de infecção por bactérias Grampositivas Gramnegativas anaeróbias quer sejam elas bactérias cocoides bacilares ou encurvadas Ainda reconheceuse a importância dos diferentes protocolos estabelecidos a fim de garantir eficiência na realização dos ensaios e qualidade de resultados Nesse sentido diferentes protocolos foram reconhecidos como de urocultura hemocultura cultura de secreções de líquidos especiais como o LCR entre outros 95 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Exercícios Questão 1 Leia o texto a seguir A competitividade e o alto custo tornam a cada momento mais difícil pensar em desenvolvimento de processos sem agregar uma metodologia científica de estudo A necessidade crescente da otimização de processos minimizando custos e tempo maximizando rendimento produtividade e qualidade entre outros objetivos tem levado profissionais de diferentes formações a buscarem técnicas e ferramentas sistemáticas de planejamento gerencial e de experimentos O laboratório clínico é uma estrutura prestadora de serviço especializado presente na grande maioria das instituições de assistência médica com a finalidade de fornecer recursos diagnósticos complementares Além da realização das análises laboratoriais necessárias ao atendimento médico o laboratório contribui para a formação médica e de outros profissionais que atuam em laboratório farmacêutico veterinário e biomédico no que se refere ao bom uso dos recursos diagnósticos disponíveis ou potenciais SAMPAIO T L Mapeamento do conhecimento nos processos de rotina de laboratório de microbiologia clínica Dissertação Universidade Federal de Santa Catarina 2017 Disponível em httpsbitly3AmRWj9 Acesso em 17 jun 2021 com adaptações A rotina e os procedimentos realizados em um laboratório clínico são fundamentais tanto para o atendimento aos clientespacientes quanto para o sucesso do empreendimento Nesse contexto o conhecimento sobre os equipamentos e suas funções é essencial A respeito desse tema avalie as afirmativas I A autoclave fornece a temperatura ideal para a incubação dos microrganismos o que favorece o crescimento deles II A estufa bacteriológica é um equipamento que faz a esterilização usando o calor úmido do vapor temperatura de ebulição de 121 C o que causa a desnaturação de proteínas dos microrganismos III A mesa agitadora é empregada em trabalhos com microrganismos aeróbios pois os movimentos rotatórios realizados por ela dissolvem o oxigênio do meio de cultura IV A capela de fluxo laminar é uma câmara asséptica com exaustor e lâmpada fluorescente na qual se realiza o procedimento de repicagem de microrganismos 96 Unidade I Assinale a alternativa correta A Apenas a afirmativa I é correta B Apenas a afirmativa III é correta C Apenas as afirmativas III e IV são corretas DTodas as afirmativas são corretas E Nenhuma afirmativa é correta Resposta correta alternativa C Análise das afirmativas I Afirmativa incorreta Justificativa a definição de autoclave dada na afirmativa está errada pois esse equipamento é responsável pela esterilização a partir do calor úmido por meio do vapor promovese a desnaturação de proteínas dos microrganismos O equipamento consiste em uma câmara de vapor com temperatura de ebulição em torno de 121 C A autoclave é um equipamento indispensável ao laboratório de microbiologia para a esterilização de meios de cultura água e suspensões entre outros II Afirmativa incorreta Justificativa a definição de estufa bacteriológica dada na afirmativa está errada pois ao contrário do que foi dito tal equipamento não extermina microrganismos Estufas desse tipo auxiliam o crescimento dos microrganismos devido ao fato de a incubação ser em temperatura ideal III Afirmativa correta Justificativa equipamentos como o citado na afirmativa são agitadores usados para homogeneizar soluções ou para agitar substâncias viscosas por longos períodos São especialmente importantes para trabalhos com organismos aeróbicos pois podem garantir o suprimento regular de oxigênio no meio de cultura IV Afirmativa correta Justificativa as capelas de fluxo laminar têm como objetivo proporcionar um ambiente limpo para a manipulação segura de materiais biológicos ou estéreis que não podem sofrer qualquer tipo de contaminação vinda do meio externo ou de contaminações cruzadas Por tais características são especialmente importantes para o procedimento de repicagem de microrganismos 97 MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA Questão 2 Leia o texto a seguir O Staphylococcus aureus é uma bactéria gram positiva pertencente ao gênero Staphylococcus e à família Staphylococcaceae Geralmente essas bactérias agrupamse em formato de cocos que têm a aparência de cachos de uva Tratase de bactérias imóveis não esporogênicas catalase positiva e oxidase usualmente negativa Por serem microrganismos químioorganotróficos apresentam metabolismo de carboidratos respiratórios e fermentativos São susceptíveis à lise por lisostafina e resistentes à lisozima Predominantemente são associados à pele às glândulas e às mucosas de animais de sangue quente O diâmetro da sua célula situase entre 05 e 15 μm e pelo menos 11 sorotipos possuem em sua estrutura cápsula de natureza polissacarídea em que os sorotipos 6 e 7 são os mais associados às infecções em seres humanos São aeróbios ou anaeróbios facultativos e crescem em ambientes a temperaturas estabelecidas entre 18 e 40 ºC e com elevado teor de cloreto de sódio 10 O S aureus é a principal espécie do grupo de Staphylococcus spp coagulase positiva SCP e é um patógeno frequentemente associado à mastite contagiosa bovina Esses microrganismos fazem parte da microbiota humana e podem provocar doenças que vão desde uma infecção simples como espinhas e furúnculos até infecções mais graves como pneumonia meningite endocardite síndrome do choque tóxico e septicemia Nos seres humanos são as bactérias mais frequentemente encontradas na mucosa nasal as quais contaminam as mãos e desempenham papel importante na disseminação de infecções por meio dos alimentos FREITAS G D et al Uso de diferentes métodos no controle do desenvolvimento do Staphylococcus aureus uma revisão da literatura Research Society and Development 102 2021 Disponível em httpsbitly3AkdVHx Acesso em 18 jun 2021 com adaptações Com base na leitura e nos seus conhecimentos avalie as afirmativas I A elevada interação e adaptação ao homem ao animal e ao meio ambiente e a fácil aquisição de genes responsáveis por potencializar seus fatores de patogenicidade fazem com que o Staphylococcus aureus seja um grande problema de saúde pública II Estudos têm demonstrado que algumas cepas de S aureus apresentaram resistências a diferentes antibióticos o que reforça a tese de que muitas vezes o uso de antibióticos pode não ser eficaz no tratamento de patogenias causadas por esses microrganismos III Alguns dos principais testes utilizados na identificação dos microrganismos aqui em discussão são a prova da catalase o teste da resistência a novobiocina o teste da DNase e o teste da coagulase em lâmina 98 Unidade I Assinale a alternativa correta A Apenas a afirmativa I é correta B Apenas a afirmativa II é correta C Apenas as afirmativas II e III são corretas D Todas as afirmativas são corretas E Nenhuma afirmativa é correta Resposta correta alternativa D Análise das afirmativas I Afirmativa correta Justificativa estudos demonstram que esse microrganismo patogênico tem acompanhado o ser humano ao longo de parte de sua evolução As doenças causadas vão desde uma infecção simples por exemplo espinhas e furúnculos até infecções mais graves por exemplo pneumonia meningite endocardite e septicemia Embora faça parte da microbiota de humanos e outros vertebrados a intensidade de sua patogenicidade é bastante variável devido provavelmente às interações às adaptações e às alterações genéticas responsáveis por essas ações Sendo assim essa bactéria deve ser encarada como um grande problema de saúde pública II Afirmativa correta Justificativa não bastassem as diferentes doenças associadas ao S aureus esse patógeno também está se tornando resistente a antibióticos Já foram encontradas cepas com essa característica de resistência Ressaltase que o uso incorreto de antibióticos convencionais pode estar relacionado à resistência bacteriana III Afirmativa correta Justificativa os testes mencionados fazem parte de um conjunto denominado métodos para identificação presuntiva dos estafilococos Juntamente com outros testes tornam possível a identificação de Staphylococcus spp em lâminas ou em meios de cultura