Estudo de Caso AV1 Genética Forense - Análise de Esfregaço Vaginal em Casos de Estupro

Universidade Estácio de Sá Campus Norte Shopping Biomedicina Genética Forense 20221 Prof Marcelo A S Baptista ESTUDO DE CASO AV1 1 Na suspeita de casos de estupro é necessária a realização de exames para constatar a prática do abuso sexual com penetração Assim sendo nos serviços de medicina legal é realizada entre outros exames a coleta de esfregaços vaginais com a transferência do material biológico para lâmina de microscopia Em 1999 duas jovens relataram ao Departamento de Polícia do Rio de Janeiro que haviam sido vítimas de abuso sexual Um suspeito foi detido e apontado pelas vítimas como o agressor Apesar das acusações o suspeito alegou sua inocência Com objetivo de elucidar os fatos lâminas de esfregaço vaginal representando as únicas evidências biológicas dos suspeitosos casos de estupro foram enviadas ao laboratório especializado de Genética Forense três meses após o crime Os protocolos utilizados para recuperação celular e extração de DNA baseiamse em técnicas preexistentes porém adaptadas para se obter quantidade de DNA suficiente para realização das análises A quantidade de células foi suficiente para a utilização da técnica de extração diferencial de DNA separando as frações feminina e masculina Após a extração do DNA uma amplificação por PCR foi realizada usando um kit multiplex com 9 loci de STR mais amelogenina Os resultados obtidos foram compilados na Tabela 1 Adaptado de Silva D A Góes A C S Carvalho J J Carvalho E F DNA typing from vaginal smear slides in suspected rape cases São Paulo Med J 1222 7072 2004 Tabela 1 Perfis genéticos de 9 loci de STR mais amelogenina obtidos de amostras questionadas e referências visando identificação criminal em dois casos de estupro AQual o objetivo investigativo ao se realizar extração diferencial de DNA a partir de esfregaço vaginal da vítima O processo foi bem sucedido Explique 10 ponto A extração diferencial de DNA foi realizada com o propósito de separar e isolar o DNA da fração espermática masculina misturada à fração epitelial feminina da vítima e com isso obter o perfil genético exclusivamente masculino a partir do esfregaço vaginal da vítima simplificando a comparação entre amostra questionada e amostra referência e a interpretação do resultado A fração espermática masculina foi completamente isolada obtendose somente o perfil Caso 1 Caso 2 Suspeito Locus Sangue vítima Esfregaço vaginal fração feminina Esfregaço vaginal fração masculina Sangue vítima Esfregaço vaginal fração feminina Esfregaço vaginal fração masculina Sangue suspeito Frequência genotípica suspeito CSF1PO 8 10 8 10 10 12 8 8 8 8 10 12 10 12 0189 TPOX 8 12 8 12 8 9 11 13 11 13 8 9 8 9 0093 THO1 7 93 7 93 6 7 6 93 6 93 6 7 6 7 0090 F13AO1 4 12 4 12 4 5 5 5 5 5 4 5 4 5 0034 FESFPS 10 11 10 11 9 11 10 11 10 11 9 11 9 11 0062 VW15A 18 19 18 19 17 18 15 16 15 16 17 18 17 18 0077 D16S539 10 11 10 11 11 12 12 13 12 13 11 12 11 12 0148 D7S820 8 11 8 11 10 12 10 13 10 13 10 12 10 12 0093 D13S317 8 12 8 12 8 11 11 12 11 12 8 11 8 11 0087 Amelo XX XX XY XX XX XY XY Frequência genotípica combinada 1 em 3300000000 genético masculino enquanto a partir da fração epitelial apenas o perfil genético feminino demonstrando o sucesso da extração diferencial de DNA B Identifique as amostras questionadas e as amostras referências analisadas 10 ponto Amostra questionada esfregaços vaginais das vítimas Amostra referência sangue das vítimas e do suspeito C Como foram calculadas as frequências genotípicas por locus e a frequência genotípica combinada referentes ao perfil do suspeito 10 ponto Para o cálculo das frequências genotípicas por locus foi utilizada a fórmula 2pq visto que todos os genótipos são heterozigotos substituindo as variáveis p e q pelos valores das frequências alélicas estimadas a partir de amostragem representativa da população referencial carioca A frequência genotípica combinada é dada pelo produto de todas as frequências genotípicas calculadas DA comparação direta dos perfis genéticos obtidos a partir das amostras analisadas juntamente com a informação do banco de dados de frequências alélicas da população referencial possibilitou a seguinte interpretação estatística referente ao suspeito É aproximadamente 3300000000 três bilhões e trezentos milhões de vezes mais provável que encontremos o perfil genético observado se considerarmos que as amostras questionadas são provenientes do doador da amostra referência do que se considerarmos que são provenientes de outra pessoa qualquer da população A expressão verbal acima visa quantificar a força da evidência genética identidade entre o perfil genético da amostra questionada e o da amostra referência estimando a razão de probabilidades ou índice de coincidência cumulativo da evidência genética sob duas hipóteses alternativas mutuamente exclusivas Quais são essas hipóteses H0 a amostra questionada é proveniente do doador da amostra referência H1 a amostra questionada é proveniente de outra pessoa qualquer da população Qual hipótese deve ser aceita H0 A que conclusão se chega Responda em linguagem técnica pericial 20 pontos Com base na análise dos sistemas genéticos independentes está evidenciada a condição de identidade entre o doador da amostra referência suspeito e as amostras questionadas NOTA TÉCNICA Extração Diferencial de DNA A extração diferencial de DNA é uma técnica de extração modificada que permite a lise seletiva e o isolamento do DNA de uma mistura de espermatozoides e células epiteliais Figura 1 Amostras forenses como as coletadas em casos de violência sexual podem conter espermatozoides evidência misturados com células epiteliais vaginais eou retais referência Técnicas de extração diferencial permitem o isolamento físico seletivo da fração masculina da amostra forense antes da obtenção do perfil genético Durante a extração diferencial as células epiteliais são primeiro seletivamente lisadas através da adição de dodecilsulfato de sódio SDS e proteinase K Os espermatozoides são geralmente resistentes à lise por esses produtos químicos Uma vez que as células epiteliais tenham sido lisadas a centrifugação é usada para sedimentar seletivamente quaisquer espermatozoides intactos O sobrenadante contendo o DNA das células epiteliais pode então ser removido para um tubo separado Os espermatozoides isolados são então lisados pela adição de SDS proteinase K e ditiotreitol DTT Figura 1 O DTT é um forte agente redutor que desestabiliza as pontes dissulfeto de proteínas presentes nas membranas nucleares do espermatozoide liberando o DNA das células espermáticas O DNA na fração epitelial e na fração espermática pode então ser extraído separadamente por métodos orgânicos ou não orgânicos O método de extração diferencial pode simplificar a interpretação dos resultados do perfil genético em casos de crime sexual aumentando a probabilidade de obter perfil de DNA exclusivamente masculino isolado da fração espermática Figura 2 Como a fração epitelial pode conter tanto o DNA feminino quanto eventualmente o masculino por contaminação com células epiteliais masculinas um perfil característico de mistura de amostras biológicas com três ou mais alelos é passível de ser obtido a partir da fração não espermática Figura 1 Fluxograma de extração diferencial de DNA Comumente empregada para o processamento de evidências de violência sexual as células epiteliais são primeiramente lisadas deixando espermatozoides intactos que são facilmente sedimentados por centrifugação A remoção do lisado de células epiteliais para um tubo separado deixa um sedimento enriquecido de espermatozoides A desnaturação subsequente das ligações dissulfeto de proteínas da membrana nuclear espermática pelo agente redutor DTT facilita a lise dos espermatozoides para a extração do DNA SDS e Proteinase K Incubar e Centrifugar Transferir Sobrenadante Lisado da Fração Epitelial Ressuspender Sedimento Espermático Lisado da Fração Espermática SDS Proteinase K e DTT Lisado da Fração Epitelial DNA Epitelial DNA Espermático IsolarPurificar DNA por Extração Orgânica ou Fase Sólida IsolarPurificar DNA por Extração Orgânica ou Fase Sólida DTT Figura 2 Representação esquemática ilustrando os resultados das quatro amostras tipicamente associadas a um caso de violência sexual Durante a extração diferencial de DNA a amostra questionada é dividida em duas frações a fração nãoespermática ou epitelial e b fração espermática O perfil genético do suspeito d é comparado com a fração espermática b para averiguar possível identidade O perfil genético da vítima c fornece confirmação da identidade da amostra referência com a fração não espermática a Amostra Questionada Q Amostra Referência R Fração Epitelial Fração Espermática Vítima Suspeito Extração Diferencial 2 Nota A história seguinte é ficcional mas reflete a forma como a análise genética é empregada nas investigações forenses No local de um violento assalto os peritos encarregados do local do crime encontraram a ponta de um cigarro que acreditavam ter sido deixada por um dos assaltantes Os peritos geneticistas encontraram saliva na ponta do cigarro e foram capazes de produzir um perfil genético a partir do DNA contido na saliva Figura 1 Figura 1 Perfil genético de 8 de crime A polícia prendeu duas mulheres Linda e Maria que suspeitavase estarem envolvidas no crime Cada uma das suspeitas forneceu uma amostra de esfregaço bucal que foram usadas para obter os respectivos perfis genéticos Figura 2 Figura 2 Perfis genéticos de 8 loci de STR mais amelogenina obtidos de esfregaços bucais de Linda A e Maria B As frequências genotípicas combinadas dos perfis genéticos mostrados na Figura 2 A e B foram estimadas em 1 em 85 bilhões e 1 em 7 bilhões respectivamente Adaptado Müller S GöllnerHeibült H Genetic fingerprinting a look inside Science in School 22 4956 2012 Com base nos dados acima apresentados examine o caso criminal em questão e redija as partes do laudo pericial correspondentes à análise e interpretação dos resultados e conclusão Análise e Interpretação dos Resultados B A 1 A análise do local genético amelogenina revelou tratarse de um indivíduo do sexo feminino XX o doador da amostra questionada saliva na ponta do cigarro 2 O perfil genético do doador da amostra referência Linda apresentou coincidência com o perfil da amostra questionada estabelecendo assim a condição de identidade e portanto as amostras provêm de uma mesma pessoa 3 É aproximadamente 8500000000 oito bilhões e quinhentos milhões de vezes mais provável que encontremos o perfil genético observado se considerarmos que a amostra questionada é proveniente do doador da amostra referência Linda do que se considerarmos que é proveniente de outra pessoa qualquer da população 4 O perfil genético da amostra referência Maria não apresentou coincidência com o perfil da amostra questionada em 7 dos 8 locais genéticos estudados estabelecendo assim a condição de não contribuidor Conclusão Com base na análise dos sistemas genéticos independentes está evidenciada a condição de identidade entre o doador da amostra referência Linda e o doador da amostra questionada bem como fica estabelecida a condição de não contribuidor não coincidência entre o doador da amostra referência Maria e a amostra questionada